МУК 4.1.2777-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фамоксадона в луке-перо и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 24 ноября 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
24 ноября 2010 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФАМОКСАДОНА В ЛУКЕ-ПЕРО И ЛУКЕ-РЕПКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2777-10
с момента утверждения
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Свидетельство об аттестации методики № 0030.28.05.10 от 31.05.2010.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Фамоксадона в луке-перо и репке-луке в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.
Название действующего вещества по ИЮПАК:
3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H № O . 22 18 2 4
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: светлый кремовый без запаха. -7
Давление паров: 6,4 х 10 Па (при 20 °С). Коэффициент распределения октанол - вода: K log P = 4,8 (pH 5),
ow
K log P = 4,65 (pH 7), K log P = 5,55 (pH 9). ow ow
Температура плавления: 141,3 — 142,3 °С. -6
Растворимость в воде, г/куб. дм (20 °С): pH 5 — 243 х 10 ; pH 7 — 111 -6
х 10 ; при pH 9 вещество быстро гидролизуется. Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °С):
н-октанол — 1,78; этилацетат — 124; ацетон — 274; ацетонитрил — 125; гексан
- 0,0476; дихлорметан — 239; метанол — 10; толуол — 13,3.
Фамоксадон нестабилен в водных растворах. Подвергается гидролизу в диапазоне pH 5 - 9, DT составляет 41 день, 2 дня и 93 минуты при pH 5,0;
50
7,0 и 9,0 соответственно.
DT при фотолизе составляет 4,6 дней и 3,9 часов при pH 5 и 7,75 50 соответственно. При фотолизе образуются устойчивые к фотолизу метаболиты Фамоксадона и двуокись углерода.
В лабораторных условиях период полуразложения DT в почве составляет 6 50
дней в аэробных условиях и 28 дней - в анаэробных. Деградация происходит путем гидроксилирования и раскрытия кольца с образованием производных гликолевой кислоты. Первичная деградация была микробной и ускорялась под
действием света.
Краткая токсикологическая характеристика: Фамоксадон относится к веществам мало опасным по острой пероральной и дермальной токсичности (ЛД 50
для крыс более 2000 мг/кг), но умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК для крыс (4 часа) более 5300 мг/куб. м). Не обладает
50
генотоксичностью и онкогенными свойствами, не оказывает влияния на репродуктивную функцию. Из организма крыс Фамоксадон быстро выводится в
неметаболизированном виде.
Область применения: Фамоксадон — фунгицид контактного действия из группы оксазолидиндионов. Является ингибитором митохондриального дыхания, высокоэффективен против широкого спектра патогенных грибов с рекомендуемой нормой расхода 50 — 200 г/га.
Применяется против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 0,15 кг д.в./га, также предлагается для применения на томатах, подсолнечнике, луке и виноградниках.
В России для Фамоксадона установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД — 0,01 мг/кг массы тела человека; ОДК в почве — 0,1 мг/кг; ПДК в воде (общ.) — 0,01 мг/куб. дм; ОБУВ воздухе рабочей зоны — 1,0 мг/куб. м; ОБУВ в атмосферном воздухе — 0,01 мг/куб. м; МДУ в картофеле — 0,05 мг/кг; в томатах — 0,2 мг/кг; в винограде — 0,25 мг/кг; в семенах и масле подсолнечника — 0,1 мг/кг, луке-репке — 1,0 мг/кг.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ ФАМОКСАДОНА
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Лук-репка | 0,10 — 0,50 вкл. | 25 | 3,2 | 8,9 | 10,7 |
| 0,05 — 0,10 вкл. | 50 | 2,1 | 5,8 | 6,9 | |
| Лук-перо | 0,10 — 0,50 вкл. | 25 | 4,5 | 12,5 | 14,9 |
| 0,05 — 0,10 вкл. | 50 | 3,9 | 10,8 | 12,9 |
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА ДЛЯ ФАМОКСАДОНА
| Анализируемый | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | предел обнаружения, мг/кг | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | полнота извлечения вещества, % | стандартное отклонение, S, % | доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
| Лук-репка | 0,05 | 0,05 — 0,50 | 75,8 | 5,8 | 2,3 |
| Лук-перо | 0,05 | 0,05 — 0,50 | 76,3 | 9,1 | 3,2 |
Метод основан на определении Фамоксадона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами на колонках с Флоризилом и на колонках с окисью алюминия.
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
3.1 Средства измерений
Весы аналитические «OHAUS», EP 114 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности по ГОСТ 24104-1 — специальный (I)
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г «ACCULAB» V600, соответствуют классу точности по ГОСТ 24104-1 — средний (III)
Колбы мерные на 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см ГОСТ 29227-91
Хроматограф жидкостный Waters 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации № 15311-02
Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см ГОСТ 1770-74.
Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Фамоксадон, CAS 131807-57-3, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 97,7%, фирма Dr. Ehreustorfer GmbH, аккредитованная по ИСО-9001-2000
Алюминий, окись для хроматографии, ч ТУ 6-09-3916-75 Ацетон, осч ТУ 6-09-3513-86 Ацетонитрил, осч, УФ-200 нм ТУ 6-09-2167-84
Вода бидистиллированная (бидистиллят), деионизированная или перегнанная над KMnO ГОСТ 6709-72 4
Гелий очищенный марки "А" ТУ 51-940-80 n-Гексан, хч ТУ 6-09-3818-89
Калий марганцовокислый, хч ГОСТ 20490-75
Кальций хлористый, ч ТУ 6-09-4711-81
Кислота ортофосфорная (85%), чда ГОСТ 6552-80
Метилен хлористый, хч ТУ 6-09-2662-77
Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ 4166-76
Этилацетат, чда ГОСТ 22300-76
Флоризил(R) (Магния силикат, 99%, CAS 1343-88-0) для колоночной хроматографии, зернение 60/100 меш, фирма «Acros Organics».
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Алонж прямой с отводом для вакуума (АО-14/23) для работы с концентрирующими патронами ГОСТ 25336-82
Аппарат для встряхивания проб «SKLO UNION TYP LT1»
Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, фирма «NALGENE»
Ванна ультразвуковая «UNITRA» UNIMA OLSZTYN UM-4
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная ГОСТ 5556-81
Воронки делительные на 250 куб. см ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные стеклянные ГОСТ 25336-82
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480, фирма «Buchi»
Колбы конические плоскодонные на 100, 250, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 25336-82
Колбы круглодонные со шлифом (концентраторы) на 100, 250 куб. см и 4000 куб. см ТС ТУ 92-891.029-91
Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм с внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма «Waters»
Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport
Предколонка хроматографическая стальная, Symmetry C 8, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters»
Стаканы стеклянные термостойкие объемом 100 — 500 куб. см ГОСТ 25336-82
Установка для перегонки растворителей с круглодонной колбой объемом 4000 куб. см и приемной конической колбой объемом 1000 куб. см
Фильтры бумажные «красная лента» ТУ 6-09-1678-86
Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма «Waters».
Допускается использование оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению определений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с Флоризилом и колонок с окисью алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с Флоризилом и на колонках с окисью алюминия, установление градуировочной характеристики.
7.1 Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетона
Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.
Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.
7.1.2 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.
7.1.3 Приготовление бидистиллированной воды
Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 часов. Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.
7.2 Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление рабочих растворов
7.2.1.1 Приготовление 2%-ного раствора сульфата натрия.
20 г безводного сульфата натрия переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, добавляют 200 — 300 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.
7.2.1.2 Приготовление 0,1%-ного раствора калия марганцовокислого.
1 г калия марганцовокислого переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, добавляют 200 — 300 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.
7.2.2 Приготовление растворов для жидкостной хроматографии
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и 3,1 мМ раствор ортофосфорной кислоты.
7.2.2.1 Приготовление 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты.
Мерной пипеткой отбирают 0,42 куб. см концентрированной (85%-ной) ортофосфорной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу объемом 2000 куб. см, куда предварительно наливают около 500 куб. см очищенной воды. Затем раствор перемешивают и доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).
7.2.2.2 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.
В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 650 куб. см ацетонитрила и 350 куб. см 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты в очищенной воде. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
7.2.3 Приготовление градуировочных растворов
7.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией Фамоксадона 1,0 мг/куб. см.
Взвешивают 50 мг Фамоксадона в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.
7.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией Фамоксадона 10,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для построения калибровочной кривой.
7.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией Фамоксадона 5,0 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 3 используется для построения калибровочной кривой.
7.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией Фамоксадона 0,5 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 4 используется для построения калибровочной кривой.
7.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией Фамоксадона 0,2 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 5 используется для построения калибровочной кривой.
7.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией Фамоксадона 0,1 мкг/куб. см.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор № 6 используется для построения калибровочной кривой.
7.2.3.7. Стандартные растворы Фамоксадона с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; и 0,5 мкг/куб. см для внесения в образцы.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; и 0,5 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.
7.3 Построение калибровочной кривой
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Фамоксадона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.
7.4 Подготовка колонки с окисью алюминия
для очистки экстракта и проверка хроматографического
поведения Фамоксадона
7.4.1 Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.
7.4.2 Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на колонке с окисью алюминия
В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.
Изучение поведения Фамоксадона на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
7.5 Подготовка колонки с Флоризилом для очистки экстракта
и проверка хроматографического поведения Фамоксадона
7.5.1 Подготовка колонки с Флоризилом для очистки экстракта
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г Флоризила с зернением 60/100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой Флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.
Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см смеси гексан — этилацетат в соотношении 2:1, избыток растворителя с колонки удаляют путем продавливания воздуха. Затем колонку дополнительно промывают 10 куб. см гексана. Перед внесением экстракта на колонку ее промывают дополнительно 5 куб. см гексана.
7.5.2 Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на колонке с Флоризилом
В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, тщательно обмывают стенки концентратора, затем добавляют в колбу 5 куб. см гексана и полученную смесь вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Исходную колбу обмывают 15 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 10:1 и вносят на колонку. Затем колонку последовательно промывают тремя порциями смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:1 объемом 10 куб. см каждая. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток после упаривания каждой фракции растворяют в 2 мл ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.
Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.
Изучение поведения Фамоксадона на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии Флоризила.
7.6 Подготовка и кондиционирование колонки
для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 — 4 часа.
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.1979), а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-2001 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ».
Пробы целого растения лука и репки лука хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 — 4 °С не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С до 2-х лет.
9.1 Лук-перо и лук-репка
9.1.1 Экстракция и очистка полученного экстракта
Образец измельченного зеленого лука (или лука-репки) массой 10 г помещают в банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 15 минут, а затем на 20 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в делительную воронку объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 10 минут, а затем на 10 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 куб. см.
К полученному экстракту добавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом 50 куб. см. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 40 куб. см хлористого метилена, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят смыв в делительную воронку объемом 500 куб. см. Затем концентратор обмывают еще двумя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см и все смывы объединяют в делительной воронке. Туда же прибавляют 100 куб. см 2%-ного раствора сульфата натрия и встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) помещают в химический стакан объемом 200 куб. см, верхний (водный) слой отбрасывают.
Хлористый метилен из химического стакана переносят в чистую делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют 100 куб. см 2%-ного раствора сульфата натрия, 10 куб. см 0,1%-ного раствора перманганата калия и повторяют процедуру промывки. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия, осушитель обмывают 10 куб. см хлористого метилена, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.3 Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на заранее подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 куб. см ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
9.1.4 Очистка экстракта на колонке с Флоризилом
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.3, растворяют в 0,5 куб. см этилацетата, обмывая стенки концентратора, затем в концентратор прибавляют 5 куб. см гексана, тщательно перемешивают и полученную смесь вносят на заранее подготовленную колонку. Колонку промывают 15 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 10:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки 20 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 2:1, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм раствора вводят в хроматограф.
9.2 Условия хроматографирования
Хроматограф жидкостный Waters 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации № 15311-02, или другой с аналогичными характеристиками.
Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».
Предколонка стальная Symmetry C8, 20 мм х 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма «Waters».
Подвижная фаза: ацетонитрил — 3,1 мМ ортофосфорная кислота в соотношении 650:350.
Время удерживания Фамоксадона: 10,835 мин. +/- 2%.
Чувствительность не менее 0,003 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Millenium 3.05.01.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание Фамоксадона рассчитывают по формуле:
S х A х V
пр
X = ------------- х P, 100 х S х m ст
где:
X - содержание Фамоксадона в пробе, мг/кг;
S - высота (площадь) пика стандарта, мм;
ст
S - высота (площадь) пика образца, мм;
пр
A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемого образца, г (куб. см);
P - содержание Фамоксадона в аналитическом стандарте, %.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 |X - X | х 100
1 2
----------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 х сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг ,при вероятности P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг» <*>.
<*> 0,05 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = X' - X - C , к д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 |X - X | х 100
1 2
----------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
табл. 1), %.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФАМОКСАДОНА ИЗ ПЕРА И РЕПКИ ЛУКА
(5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ, P = 0,95)
| Среда | Внесено Фамоксадона, мг/кг | Обнаружено Фамоксадона, мг/кг | Полнота извлечения, % |
| Лук-репка | 0,05 | 0,0405 +/- 0,0003 | 80,9 |
| 0,10 | 0,0748 +/- 0,0053 | 74,8 | |
| 0,20 | 0,1412 +/- 0,0051 | 70,6 | |
| 0,50 | 0,3832 +/- 0,0064 | 76,6 | |
| Лук-перо | 0,05 | 0,0421 +/- 0,0040 | 84,2 |
| 0,10 | 0,0726 +/- 0,0029 | 72,6 | |
| 0,20 | 0,1471 +/- 0,0187 | 73,5 | |
| 0,50 | 0,3733 +/- 0,0233 | 74,7 |