МУК 4.1.2689-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 31.10.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.2689-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.2689-10. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-2689-10
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 октября 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
2 августа 2010 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИМЕТОМОРФА В ЯГОДАХ ВИНОГРАДА И ВИНОГРАДНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2689-10
1 октября 2010 года
1. Разработаны сотрудниками Всероссийского НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.
4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.
Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в ягодах и соке винограда массовой концентрации диметоморфа в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.
Действующее вещество: Диметоморф.
Структурная формула (не приводится).
Брутто формула: C H ClNO . 21 22 4
(E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC)
(E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил)-1-оксо-2-пропенил]морфолин (CAS).
Смесь изомеров представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 125,2 - 149,2 °C. (E)-изомер имеет температуру плавления
-4
136,8 — 138,3 °C, давлением паров 9,7 x 10 мРа (25 °C). (Z)-изомер имеет -3 температуру плавления 166,3 — 168,5 °C, давлением паров 1,0 x 10 мРа (25 °C).
Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K lg P = 2,63 для ow (E)-изомера; 2,73 для (Z)-изомера (20 °C). Растворимость в воде 81,1 (pH 5), 49,2 (pH 7), 41,8 (pH 9) (мг/куб. дм, 20 °C).
Растворимость в органических растворителях (мг/куб. дм, 20 °C): н-гексан — 0,11; толуол — 49,5; дихлорметан — 461; метанол — 39; ацетон — 100; этилацетат — 48,3.
Гидролитически и термически стабилен в нормальных условиях. (E)- и (Z)-изомер переходят друг в друга на свету.
Краткая токсикологическая характеристика: LD для крыс 3500 — 4300, 50 мышей 3700 — 5000 мг/кг. Острая кожная активность для крыс LD > 50 5000 мг/кг. Не ирритант для кожи и глаз (кролики). Ингаляционная активность
LC > 4,2 мг/куб. дм. LD для пчел > 100 мкг/особь. 50 50
Область применения: локальный системный фунгицид, ингибитор образования клеточной стенки грибного оомицета, ингибитор роста и спороношения грибов.
Гигиенические нормативы: ВМДУ диметоморфа в винограде 0,5 мг/кг.
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/куб. дм) | Норматив точности (границы относительной погрешности), +/- дельта, % | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Ягоды винограда | 0,01 — 0,10 | <= 50 | 6 | 16,6 | 28 |
| Виноградный сок | 0,01 — 0,10 | <= 50 | 7 | 19,4 | 28 |
ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Ягоды винограда | 0,01 | 0,01 — 0,10 | 88,7 | 7,5 | 15 |
| Виноградный сок | 0,01 | 0,01 — 0,10 | 84,8 | 7,7 | 15,5 |
Методика основана на определении диметоморфа методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз, и очистки ацетонитрильного экстракта силикагелем с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.
Идентификация диметоморфа проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерения
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104-2001
Весы технические ВЛКТ-500 ГОСТ 24104-80
Колбы мерные на 10, 25, 50, 100 куб. см ГОСТ 23932-90
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
Пипетки градуированные ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см ГОСТ 23932-90
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы и материалы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч. ТУ 6-09-3534-87
Вода бидистиллированная, деионизированная ГОСТ 6709-79
Диметоморф с содержанием основного компонента 99,7% (Shell Research Limited)
Кислота ортофосфорная, х.ч. ГОСТ 6552-80
Кислота уксусная, ледяная ГОСТ 61-69 Магний сернокислый безводный, х.ч. ГОСТ 4523-67
Натрий уксуснокислый, ч. ГОСТ 199-68
Силикагель, Merck 1.09385.1000
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М
H PO в соотношении 50:50 3 4
Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters)
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Концентрирующие патроны Диапак C16 (БиоХимМак)
Пробирки с притертыми пробками на 10, 20 куб. см ГОСТ 25336-82
Фильтры бумажные "красная лента" ТУ 6.091678-86 Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2 ТУ 5.375-4261-76
Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.
4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны».
5. Требования к квалификации операторов
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.
При выполнении измерений выполняют следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7.1 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку (Acquity BEH C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.
7.2 Приготовление растворов
7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98%-ной ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.
7.3 Приготовление основного и градуированных растворов
7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску диметоморфа (50 +/- 0,5 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем ацетонитрилом до метки).
Градуировочные растворы с концентрациями 0,01, 0,02, 0,05 и 0,1 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).
7.3.2. Раствор № 1 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см пипеткой вносят 1 куб. см основного раствора и доводят до метки раствором подвижной фазы (5 мкг/куб. см). Затем 10 куб. см полученного раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 100 куб. см и вновь доводят до метки раствором подвижной фазы (0,5 мкг/куб. см). После этого в мерную колбу на 100 куб. см вносят 20 куб. см полученного после второго разбавления раствора и доводят до метки раствором подвижной фазы (0,1 мгк/куб. см).
7.3.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,05 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 50 куб. см раствора № 1 и доводят до метки раствором подвижной фазы.
7.3.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,02 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 40 куб. см раствора № 2 и доводят до метки раствором подвижной фазы.
7.3.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,01 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 20 куб. см раствора № 2 и доводят до метки раствором подвижной фазы.
Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.
При изучении полноты определения диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества. Например, раствор внесения с концентрацией диметоморфа 0,1 мкг/куб. см готовят из основного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом аналогично п. 7.3.2.
7.4 Построение градуировочного графика
Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация диметоморфа в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации диметоморфа в градуировочном растворе.
Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:
где S — площадь пика градуировочного раствора. Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не хуже 0,99.
Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.
Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:
|C - C |
к
-------- x 100 <= лямбда , C контр.
C — аттестованное значение массовой концентрации диметоморфа в градуировочном растворе;
C — результат контрольного измерения массовой концентрации к диметоморфа в градуировочном растворе;
лямбда — норматив контроля градуировочного коэффициента, %. контр. (лямбда = 10% при P = 0,95). контр.
Отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия». Пробы ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение недели.
9.1 Определение диметоморфа в виноградном соке
Перед проведением анализа пробу отфильтрованного через бумажный фильтр виноградного сока объемом 10 +/- 0,05 куб. см пропускают через концентрирующий патрон Диапак C16. Фильтрат отбрасывают. Диметоморф элюируют 10 куб. см смеси ацетонитрила и воды в соотношении 4:1. Элюат собирают, переносят в тефлоновую центрифужную пробирку и дальнейшую обработку проводят по п. 9.2.
9.2 Определение диметоморфа в ягодах винограда
Гомогенизированные пробы ягод винограда массой 10 +/- 0,1 г помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 2 куб. см воды, 8 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 минут и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 минут. Измеряют объем супернатанта и количественно переносят его в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Прибавляют силикагель и безводный сульфат магния из расчета 50 мг силикагеля и 150 мг сульфата магния на 1 куб. см супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 минут и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 минут. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем до метки 0,005 М фосфорной кислотой. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.
9.3 Условия хроматографирования
Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.
Время удерживания E-диметоморфа 3,2 +/- 0,1 мин.
Время удерживания Z-диметоморфа 4,5 +/- 0,1 мин.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,01 — 0,1 мкг/куб. см.
Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
x x
(S + S ) x K x V
1 2
x x (S + S ) - сумма площадей пиков изомеров диметоморфа в анализируемой 1 2
пробе, кв. мм (AU);
K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения градуировочной зависимости (мкг/куб. см : кв. мм);
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;
P — навеска анализируемого образца, г, для виноградного сока — объем в куб. см;
f — коэффициент извлечения диметоморфа = 100 / полноту определения (приведенную в табл. 2, например, для ягод винограда 100 / 88,7 = 1,13).
Содержание остаточных количеств диметоморфа в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор диметоморфа 0,1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1).
2 x |X - X | x 100
1 2
(X + X )
1 2
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг; 1 2
r — значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ). r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг <*>).»
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/кг, при этом: ДЕЛЬТА = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,
л
где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
ДЕЛЬТА = дельта x X / 100,
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры (К ) рассчитывают по формуле: к
К = X' - X - C , к д где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . (1) л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К). Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг; 1 2 R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.