МУК 4.1.2548-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флумиоксазина в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 09.09.2009)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 декабря 2009 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
9 сентября 2009 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУМИОКСАЗИНА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2548-09
1 декабря 2009 года
1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 июня 2009 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 сентября 2009 г.
4. Введены в действие с 1 декабря 2009 г.
1.1 Краткая характеристика препарата
Действующее вещество: флумиоксазин.
Название действующего вещества по номенклатуре ИЮПАК: N-(7-фтор-3,4-дигидро-3-оксо-4-проп-2-инил-2H-1,4-бензоксазин-6-ил)-циклогекс-1-ен-1,2-дикарбоксамид.
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H FN O . 19 15 2 4
Химически чистое вещество: желтовато-коричневый порошок без запаха.
Температура плавления: 202 — 204 °С.
Давление пара при 22 °С: 0,32 мПа. K log P = 2,55 (20 °С). ow
Растворимость в воде (25 °С) - 1,79 г/л, растворим в большинстве органических растворителей. Гидролиз: DT 4,2d (pH 5), 1d (pH 7), 0,01d
50
(pH 9). Стабилен при хранении.
1.2 Краткая токсикологическая характеристика
ЛД для крыс и мышей > 5000 (ЛД дерм. > 2000) мг/кг. СК (96 ч, в 50 50 50 мг/л): для ушастого окуня > 21, для радужной форели 2,3. Минимально
раздражает глаза, не раздражает кожу кроликов.
Гигиенические нормативы: МДУ для подсолнечника не установлен.
1.3 Область применения препарата
Гербицид для борьбы с однолетними двудольными и некоторыми однолетними злаковыми сорными растениями на посевах подсолнечника, сои, кукурузы и других.
в семенах и масле подсолнечника методом ВЭЖХ
2.1 Основные положения
2.1.1. Область применения и принцип метода. Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств флумиоксазина в семенах подсолнечника в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг, в масле подсолнечника — 0,025 — 0,25 мг/кг.
Методика основана на определении флумиоксазина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетонитрильной смесью с последующей очисткой жидкостной экстракцией и на концентрирующих патронах.
2.1.2. Метрологические характеристики. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена подсолнечника | 0,05 — 0,1 0,1 — 0,5 | 50 25 | 4,2 4,6 | 11,8 12,9 | 12,9 15,5 |
| Масло подсолнечника | 0,025 — 0,1 0,1 — 0,25 | 50 25 | 3,6 3,8 | 10,1 10,6 | 12,1 12,7 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ФЛУМИОКСАЗИНА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена подсолнечника | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 86,5 | 5,2 | 4,7 |
| Масло подсолнечника | 0,025 | 0,25 — 0,25 | 90,9 | 4,8 | 4,4 |
2.1.3. Избирательность метода. Избирательность метода определения флумиоксазина достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.
2.2 Реактивы и материалы
Ацетон, ос.ч. ТУ 6-09-3513-86 Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-200нм", Сорт 5 или х.ч. ТУ 6-09-3534-87 Бумажные фильтры "красная лента" ТУ 6.091678-86
Вода бидистиллированная, деионизированная ГОСТ 6709-79
Флумиоксазин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 100% (Сумитомо Кем. Со Лтд)
Кислота ортофосфорная, х.ч., 0,005 М водный раствор ГОСТ 6552-80
н-Гексан, х.ч., свежеперегнанный ТУ 2631-003-05807999-98
Метанол, х.ч. ГОСТ 6995-77
Этилацетат, х.ч., с изм. 1, 2, 3 ГОСТ 22300-76
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила -
0,005 М H PO (55:45, по объему)
3 4
Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем
60 (0,040 — 0,063 mm), 0,5 г, Merck
Концентрирующие патроны Диапак С16 (0,4 г),
2.3 Приборы и посуда
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или «Breeze» фирмы «Waters», или аналогичный
Аналитические колонки ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) и Spherisorb ODS2 (2,1 х 150) мм, 3 мкм (Waters)
Баня ультразвуковая «Серьга» или аналогичная ТУ 3.836.008
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные ГОСТ 24104-2001
Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ ТУ 1-01-0593-79 Насос водоструйный ГОСТ 10696-75 Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2 ТУ 5.375-4261-76
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Шприц медицинский с разъемом Льюера ГОСТ 22090
pH-метр универсальный ЭВ-74 ГОСТ 22261-76
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС ГОСТ 10384-72 Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС ГОСТ 10384-72
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см ГОСТ 1774-74
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см ГОСТ 22292-74
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
2.4 Отбор и хранение проб
Отбор проб семян подсолнечника производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло подсолнечника хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 мес.
2.5 Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей. Органические
растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и
перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с
небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения
окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором
гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом
натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом
(на 1 куб. дм ацетона 10 г KMnO и 2 г K CO ). Ацетонитрил сушат над
4 2 3
пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно
перегоняют над углекислым калием. Этилацетат последовательно промывают
5%-ным водным раствором карбоната натрия и насыщенным раствором хлористого
кальция, высушивают над безводным карбонатом калия и перегоняют над
пентоксидом фосфора.
2.5.2. Кондиционирование колонки. Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 ч.
Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98%-ной ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.
Приготовление стандартного и градуировочных растворов
Точную навеску флумиоксазина (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы — смесь ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота (55:45, по объему).
Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.
При изучении полноты извлечения флумиоксазина используют ацетонитрильные растворы вещества.
Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация флумиоксазина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флумиоксазина в градуировочном растворе.
Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.
Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта
2.5.6.1. Кондиционирование патрона, заполненного гексадецилсиликагелем — Диапак С16 (0,4 г), осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 1 куб. см метанола и воды. Элюат отбрасывают.
2.5.6.2. Кондиционирование патрона для повторной очистки экстрактов семян и масла, заполненного силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 1 куб. см смеси гексана и этилацетата в соотношении 75:25.
2.6 Проведение определения
2.6.1. Определение флумиоксазина в семенах подсолнечника. Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см воды и 40 куб. см ацетонитрила. Флумиоксазин экстрагируют на ультразвуковой бане в течение 10 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром «красная лента». Экстракцию повторяют и объединенный экстракт дважды промывают в делительной воронке 20 куб. см гексана. Раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетонитрила. Водный остаток пропускают через концентрирующий патрон Диапак С16, откондиционированный по п. 2.5.6.1. Патрон промывают 4 куб. см воды. Фильтрат и промывку отбрасывают. Флумиоксазин элюируют 3 куб. см ацетона в чистую круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С), сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан — этилацетат (75:25), и полученный раствор количественно вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 2 куб. см смеси гексан — этилацетат (75:25). Фильтрат и промывку отбрасывают. Флумиоксазин элюируют 2 куб. см этилацетата. Полученный раствор упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С), сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм образца вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.2. Определение флумиоксазина в масле подсолнечника. Навеску масла (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 20 куб. см воды и 80 куб. см ацетонитрила и экстрагируют флумиоксазин на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Колбу помещают на 30 мин. в холодильник для более полного разделения слоев. Содержимое колбы осторожно переносят в делительную воронку, отделяют нижний слой масла и отбрасывают. Оставшийся в воронке водно-ацетонитрильный слой дважды промывают 20 куб. см гексана и упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до полного удаления ацетонитрила. Водный остаток подвергают очистке на концентрирующих патронах так же, как это описано в п. 2.6.1. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм образца вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.3. Условия хроматографирования. Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка — ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 55:45. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны 290 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм. Время удерживания флумиоксазина 3,9 +/- 0,1 мин.
Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф «Breeze» фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны 290 нм. Аналитическая колонка Spherisorb ODS2 (Waters) 150 х 2,1 мм, 3 мкм. Подвижная фаза ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 50:50. Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин. Дозируемый объем 20 куб. мм.
3. Обработка результатов анализа
Содержание флумиоксазина в образцах семян и масла подсолнечника (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х С х V
2
где:
S - площадь пика флумиоксазина в стандартном растворе (мВ х сек.);
1
S - площадь пика флумиоксазина в анализируемой пробе (мВ х сек.);
2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб.
см; P — навеска анализируемого образца, г; С — концентрация стандартного раствора флумиоксазина, мкг/куб. см.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флумиоксазина 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
_
Х +/- ДЕЛЬТА, мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта х Х
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,05 мг/кг <*>).»
<*> 0,05 мг/кг — предел обнаружения флумиоксазина в семенах подсолнечника.
6. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С >= ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д п,Х п,Х' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности п,Х п,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта х Х
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = Х' - Х - С , к д где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки
соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . п,Х' п,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
6.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
табл. 1), %.
7. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.
8. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.