МУК 4.1.2483-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение непищевых красителей Судан I, Судан II, Судан III, Судан IV и Para Red в пищевых продуктах и биологически активных добавках к пище. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 05.02.2009)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕПИЩЕВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ СУДАН I, СУДАН II, СУДАН III, СУДАН IV И PARA RED В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ К ПИЩЕ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Методические указания разработаны ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН В.А. Тутельян, к.т.н. В.Г. Байков, к.х.н. В.В. Бессонов, Ю.В. Ведищева, к.ф.н. О.И. Передеряев, Е.П. Хромченкова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 3 от 25.12.2008).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 05.02.2009.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Введение

Красители Судан I, Судан II, Судан III, Судан IV и Para Red (Пара Ред) (далее — Судан I — IV и Para Red) в сферах экономики используются при производстве дизельного топлива, в легкой промышленности для окрашивания тканей, а также при проведении биохимических исследований для окрашивания препаратов и относятся к непищевым красителям.

Необходимость определения непищевых красителей Судан I — IV и Para Red (Пара Ред) обусловлена их использованием при фальсификации специй и пряностей, а также продуктов их переработки, БАД к пище, изготовленных с использованием специй и пряностей, и других пищевых продуктов, в состав которых входят специи и пряности, с целью придания им более интенсивной окраски.

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают методику определения возможного присутствия непищевых красителей Судан I — IV и Para Red в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в специях, пряностях и продуктах их переработки, а также в биологически активных добавках к пище (БАД) и других пищевых продуктах (в состав которых входят специи и пряности).

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1.3. Присутствие непищевых красителей Судан I — IV и Para Red в пищевых продуктах в пределах обнаружения данным методом является основанием для запрещения продукции к реализации.

2. Краткая характеристика красителей Судан I, Судан II, Судан III, Судан IV и Para Red (Пара Ред)

Судан I, Судан II, Судан III, Судан IV и Para Red (Пара Ред) являются синтетическими непищевыми красителями, практически нерастворимыми в воде, хорошо растворимыми в органических растворителях (хлороформе, ацетоне, эфире), и имеющими интенсивную окраску от оранжевого до ярко-красного цвета. Структура непищевых красителей Судан I — IV и Para Red приведена на рис. 1.

Структурная формула (не приводится).

                            R           R            R
                             1           2            3
Судан I                     H           H            H
Судан II                    H           CH           H

                                      3

Судан III                   H           H            Ph-N=N-
Судан IV                    CH          H            0-CH -Ph-N=N-
                              3                          3
Para Red (Пара Ред)         H           H            NO

                                                   2

Судан I — IV и Para Red (Пара Ред)

3. Принцип метода определения красителей Судан I — IV и Para Red

Обнаружение и определение содержания непищевых красителей Судан I — IV и Para Red (Пара Ред) проводится методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с диодно-матричным детектированием (при длине волны 504 нм). В качестве арбитражного метода используют метод ВЭЖХ с масс-детектированием (по молекулярным и дочерним ионам, см. таблицу 1).

Таблица 1

ПАРАМЕТРЫ МАСС-ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ПРЕДСТАВЛЕНЫ

Наименование	Молекулярные ионы, m/z	Энергия разрушения	Основные дочерние ионы, m/z
Para Red	+ 294 (М+Н )	0,9	277	156	-
Судан-I	+ 249 (М+Н )	1,0	232	156	-
Судан-II	+ 277 (М+Н )	1,2	260	156	120
Судан-III	+ 352 (М+Н )	1,2	197	336	156
Судан-IV	+ 382 (М+Н )	1,2	224	364	156

4. Средства измерения, материалы и реактивы

• Высокоэффективный жидкостной хроматограф.
• Хроматографическая колонка С18, 5 мю, 4,6 х 250 мм.
• Ультразвуковая баня.
• Весы лабораторные общего назначения с пределом взвешивания 100 г и погрешностью + 0,0001 г.
• Дистиллятор.
• Установка для фильтрования и дегазирования подвижной фазы.
• рН-метр лабораторный.
• Центрифуга лабораторная ОПН-8, 8000 об./мин.
• Мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
• Пипетки 2-1-2-1 или 1-1-2-1, 2-1-2-10 или 2-2-2-10 или 3-2-2-10 по ГОСТ 29227.
• Колбы мерные К 1-50-1, К 1-50-2 по ГОСТ 1770-74.
• Вода дистиллированная.
• Ацетонитрил для жидкостной хроматографии.
• Тетрагидрофуран для жидкостной хроматографии.
• Трифторуксусная кислота квалификации «ОСЧ».

5. Определение содержания Суданов I — IV и Para Red методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

5.1. Подготовка стандартных растворов

Навеску стандартного вещества около 0,02 г (с точностью 0,0001 г) помещают в мерную колбу на 100 мл, добавляют 30 мл 95% этанола, интенсивно встряхивают, при необходимости озвучивают на ультразвуковой бане до полного растворения вещества. После этого объем доводят до метки 95% этанолом (основной раствор). В мерную колбу на 50 мл помещают 1 мл основного раствора и доводят объем до метки 95% этанолом (рабочий раствор). Полученный рабочий раствор фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Приготовленные стандартные растворы хранят в прохладном месте в течение 1 месяца.

5.2. Подготовка проб для анализа

Около 1,0 г (точная навеска) образца помещают во флакон объемом 20 мл с завинчивающейся крышкой, добавляют 10 мл ацетона, интенсивно встряхивают в течение 2 минут и озвучивают на ультразвуковой бане в течение 5 минут. После озвучивания образец снова встряхивают и центрифугируют на 6000 об./мин. После центрифугирования супернатант отбирают и исследуют. При необходимости отобранный супернатант фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

При подготовке контрольных образцов указанным способом извлекается более 95% добавленного количества каждого из исследуемых красителей.

5.3. Приготовление подвижной фазы

При постоянном перемешивании к бидистиллированной воде добавляют по каплям трифторуксусную кислоту до рН = 2,4 и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Подвижная фаза хранится в холодильнике при температуре 2 — 8 °С не более 3 месяцев.

5.4. Проведение анализа ВЭЖХ

Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляют путем сравнения со временем удерживания стандарта красителя, УФ и видимого спектра. Для подтверждения рекомендуется сравнивать также молекулярные массы каждого компонента и его дочерних ионов.

Идентификация красителей Судан I — IV и Para Red только по времени удерживания не будет являться достоверной ввиду сложного матрикса исследуемых объектов и наличия природных компонентов, обладающих сходными спектральными характеристиками и хроматографическим поведением.

5.5. Условия хроматографического анализа

Колонка 5u С18(2), 5 мю, 4,6 х 250 мм.

Приготовление подвижной фазы: бидистиллированную воду доводят трифторуксусной кислотой до рН 2,4 (мл на 1 л бидистиллированной воды).

Подвижная фаза: смесь ацетонитрила (А) и бидистиллированной воды, подкисленной трифторуксусной кислотой до рН = 2,4 (Б). Оптимальным является градиентное элюирование смесью ацетонитрила (А) и бидистиллированной воды, подкисленной трифторуксусной кислотой до рН = 2,4 (Б): 0 мин. — 80% (А), 10 мин. — 98% (А) (градиент линейный), 20 мин. — 98% (А), 21 мин. — 80% (А). Регенерация колонки занимает не менее 9 мин. Общее время анализа составляет 30 минут.

В случае использования только диодно-матричного детектора вместо бидистиллированной воды, подкисленной трифторуксусной кислотой до рН = 2,4, допускается использование бидистиллированной воды. Также возможно использование изократического элюирования смесью ацетонитрила — бидистиллированной воды с содержанием ацетонитрила 90 — 95% (в зависимости от параметров колонки).

Для полной регенерации колонки следует использовать подвижную фазу на основе тетрагидрофурана, обладающего такой же элюирующей силой, как и ацетон.

Скорость подачи подвижной фазы: 1,0 куб. см/мин.

Детектирование: лямбда = 504 нм.

Объем вводимой пробы 5 мкл.

Порядок выхода и параметры количественного определения непищевых красителей Судан I — IV и Para Red приведены в таблице 2. Пример хроматограммы смеси стандартов Судан I — IV и Para Red представлен на рисунке 2 (не приводится).

Таблица 2

ПРЯНОСТЯХ, ПРОДУКТАХ ИХ ПЕРЕРАБОТКИ И БАД К ПИЩЕ

N	Наименование красителя	Предел обнаружения на диодной матрице, мг/кг	Предел обнаружения на масс-детекторе, мг/кг
1	Para Red	0,5	0,5
2	Судан-I	0,5	0,5
3	Судан-II	0,5	0,5
4	Судан-III	0,5	0,5
5	Судан-IV	0,5	0,5

Проведение количественного определения красителей Судан I — IV и Para Red не является обязательным, т.к. их применение в пищевых продуктах не допускается, поскольку они являются непищевыми веществами, и их присутствие в пределах обнаружения данного метода является основанием для запрещения продукции к реализации. Пределы обнаружения красителей Судан 1 — 4 и Пара Ред приведены в таблице 2.

---

<*> Проведение количественного определения красителей Судан I — IV и Para Red не является обязательным, т.к. их применение в пищевых продуктах не допускается.

Количественное определение проводят абсолютной градуировкой.

Содержание красителей Судан I — IV и Para Red проводят по следующей формуле:

                                 S2 х C1 х V

C, мг/кг = -----------, S1 х m

где:

C, мг/кг — содержание красителя, мг/кг;

C1 — концентрация красителя в стандартном растворе, мкг/мл;

S1 — площадь пика красителя в стандартном растворе;

S2 — площадь пика красителя в определяемом образце;

V — объем раствора образца, мл;

m — масса навески, г.

Таблица 3

N	Наименование	Граница относительной погрешности (+/- дельта) в % при Р = 0,95	Стандартное отклонение повторяемости (сигма ), % r
1	Para Red	2,1	3,2
2	Судан-I	3,6	3,5
3	Судан-II	2,8	3,8
4	Судан-III	3,3	4,9
5	Судан-IV	3,9	4,3

N	Наименование	Время удерживания, мин.
1	Para Red	6,2
2	Судан-I	7,5
3	Судан-II	10,9
4	Судан-III	12,9
5	Судан-IV	15,5

---