МУК 4.1.2480-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дорамектина в пищевых продуктах. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)

2 февраля 2009 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДОРАМЕКТИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

с момента утверждения

1. Разработаны ГУ НИИ питания РАМН.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 года.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают методику определения дорамектина в мясе сельскохозяйственных животных и продуктах его переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.

Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1. Краткая характеристика препарата

Общепринятое название: дорамектин, ветранал.

Название по номенклатуре ИЮПАК: 25-циклогексил-5-O-диметил-25-ди(1-метил-пропил)авермектин. CAS: 117704-25-3.

Структурная формула (не приводится).

C H O 50 74 14

Мол. масса: 899,11.

Физические свойства: белый порошок, без запаха. Хорошо растворим в ацетонитриле.

Торговая марка: эндектоцид «Дектомакс» («Dectomax»).

Фирма-производитель: «Pfizer».

Форма выпуска: 1% раствор дорамектина в растительном масле.

Область применения. «Дектомакс» используется в качестве противопаразитарного средства широкого спектра действия для лечения и профилактики заболеваний крупного рогатого скота, овец и свиней. Средство предназначено для парентерального введения крупному рогатому скоту.

2. Методика определения остаточных количеств дорамектина в мясе сельскохозяйственных животных и продуктах его переработки методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода. Методика основана на определении остаточных

количеств  дорамектина в пищевых продуктах методом ВЭЖХ с флуориметрическим
детектированием (лямбда      = 360 нм, лямбда    - 470 нм) после экстракции
                       возб.                 эм.
дорамектина  из  образца.  Количественное  определение  проводится  методом

абсолютной калибровки.

2.1.2. Метрологические характеристики метода. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

В ТКАНЯХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ (P = 0,95, n = 10)

Анализируемый объект	Мышечная ткань, печень, почки, жир
Диапазон загрязнения, мг/кг	0,003 — 0,1	0,1 — 2,5
Предел обнаружения, мг/кг	0,001
Среднее значение степени извлечения, %	71,5	84,6
Стандартное отклонение повторяемости, S , мг/кг (в % от среднего значения) r	0,017 (22,6)	0,078 (15,6)
Предел повторяемости, r, мг/кг (в % от среднего значения)	0,047 (62,6)	0,217 (43,4)
Предел относительной погрешности результата анализа, +/- дельта, %	25,5	13,4

2.2. Реактивы

Ацетонитрил, квалификации для ВЭЖХ

Тетрагидрофуран, квалификации ос.ч.

Метанол, квалификации для ВЭЖХ н-Гексан, квалификации х.ч. ТУ 6-09-4521

Вода дистиллированная ГОСТ 6709

Натрия гидроокись, квалификации ос.ч. ГОСТ 4328

Аммиак водный (25 — 30% NH OH) квалификации ос.ч. ГОСТ 24147 4

Триэтиламин, >= 99,0% (Sigma), CAS: 121-44-8

Трифторуксусный ангидрид, >= 99,0% (Sigma)

Дорамектин (UK-67,994), 91,9%, «Pfizer»

2.3. Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы

Хроматографическая система, состоящая из жидкостного хроматографа высокого давления, дегазатора, спектрофлюориметрического детектора и системы для сбора и обработки хроматографических данных.

Колонка для ВЭЖХ, заполненная октадецилсиликагелем 250 x 4,5 мм, 5 мкм (например Phenomenex Luna C18 или аналогичная)

Микрошприц объемом 25 мкл для ВЭЖХ (Hamilton, США)

Шприц для инъекций, пластиковый, объемом 25 куб. см

Виалы стеклянные с закручивающейся крышкой «для автосамплера» (в крышке окошко, герметично закрытое резиновой вкладкой), объемом 2 — 4 куб. см

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С ТУ 64-1-2451

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г ГОСТ 24104

Ротационный испаритель ИР-1М или аналогичный ТУ 25-11-917

Блендер

Баллон со сжатым азотом квалификации «ПНГ» ГОСТ 9293

Воронка делительная на 250 куб. см ГОСТ 25336

Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 1-1000-2 ГОСТ 1770

Колбы грушевидные с конусом 14/23 вместимостью 100 куб. см ГОСТ 25336

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 100 куб. см

Пипетки 4(5)-1-2, 4(5)-2-10, 4(5)-2-25 ГОСТ 29227

Фильтры беззольные ФО-ФС-15 «красная лента» и «синяя лента» ТУ 2642-001-42624157

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных в МУК.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51447-99 «Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб». Для длительного хранения образцы продуктов замораживаются и хранятся при -18 °C до анализа.

Перед анализом образцы тщательно измельчают в гомогенизаторе или блендере.

2.5. Подготовка к проведению измерений

2.5.1. Приготовление подвижной фазы и кондиционирование хроматографической колонки. В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 530 куб. см ацетонитрила, 270 куб. см тетрагидрофурана, 200 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают и выдерживают до комнатной температуры. Раствор дегазируют. Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.

2.5.2. Приготовление стандартных растворов дорамектина. 0,050 +/- 0,001 г кристаллического дорамектина количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в ацетонитриле с массовой долей дорамектина 0,5 мг/куб. см.

Для построения градуировочной кривой методом последовательного разбавления ацетонитрилом готовят рабочие стандартные растворы с содержанием дорамектина 0,100, 0,010, 0,001 и 0,0001 мг/куб. см. Отбирают аликвоты стандартных растворов, упаривают их на ротационном испарителе при температуре не более 40 — 45 °C. Дорамектин переводят во флюоресцирующее производное, хроматографируют в трех повторностях (объем пробы 10 куб. мм). Строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации дорамектина в мг/куб. см.

Основной и рабочие стандартные растворы дорамектина хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 4 °C). Сроки годности основного раствора 12 месяцев, рабочих — 2 месяца.

2.5.3. Подготовка образца. Измельченный образец, массой 2,5 г, помещают в 20 куб. см ацетонитрила, закрывают емкость пробкой или парафильмом, помещают в теплую (40 — 50 °C) ультразвуковую баню на 20 — 25 мин. Затем охлаждают, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 5 тыс. об./мин. в течение 5 мин. Супернатант декантируют в делительную воронку и обезжиривают двумя порциями гексана по 10 куб. см. Ацетонитрильный экстракт дорамектина собирают в круглодонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 — 45 °C.

2.5.4 Получение флуоресцирующего производного дорамектина

А) Приготовление раствора аммиака в метаноле.

В виалу (крышка герметичная с резиновой вкладкой, которую можно проколоть иглой) наливают 2 — 3 куб. см метанола, крышку завинчивают. На пластиковый шприц для инъекций надевают иглу, вынимают поршень. Внутрь шприца помещают 4 — 6 гранул сухого гидроксида натрия, наливают водный аммиак и вставляют поршень. Шприц переворачивают вверх иглой, выделяющийся газ вытесняет из иглы воду, на иглу надевают виалу так, чтобы аммиак барботировал через метанол. Поршень шприца придерживают, насыщение происходит в течение 0,5 — 1 мин. Перед каждым анализом рекомендуется готовить свежий раствор аммиака в метаноле.

Б) Получение флуоресцирующего производного дорамектина.

    К остатку  после  упаривания  аликвоты  стандартного  образца или пробы
добавляют   0,15   куб.  см   ацетонитрила,  0,1  куб.  см  триэтиламина  и
0,05 куб. см  трифторуксусного  ангидрида,  смесь перемешивают и отдувают в
токе азота на водяной бане. К оставшемуся в колбе маслянистому  содержимому
добавляют  0,25  куб.  см   свежеприготовленного  2 М  раствора  аммиака  в
метаноле,  снова  отдувают  в  токе  азота  на  водяной  бане,  добавляют к
содержимому  0,4  куб. см  ацетонитрила  (объем  пробы V   = 0,5  куб. см).

                                                    пр

Аликвоту раствора образца V (от 0,005 до 0,02 куб. см) вводят в х хроматограф.

2.6. Выполнение измерений

Условия хроматографического анализа.

Хроматографическая колонка: колонка для ВЭЖХ, заполненная октадецилсиликагелем (например Phenomenex Luna C18, 250 х 4,5 мм, 5 мкм).

Подвижная фаза: ацетонитрил — 53%, тетрагидрофуран — 27%, вода — 20% об.

Скорость подачи элюента: 1,0 куб. см/мин.

    Детектирование:  флюориметрическое,  лямбда      = 360 нм,   лямбда   -
                                               возб.                   эм.

470 нм.

Объем вводимой пробы 5 — 20 куб. мм. Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,1 — 125 нг дорамектина.

Абсолютное время удерживания дорамектина в приведенных условиях — 14,5 +/- 0,1 мин.

Хроматограмма образца сала, добавка дорамектина составляет 10 мкг/кг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза, вычисляют среднюю площадь пика, соответствующего дорамектину.

2.7. Обработка результатов измерения

2.7.1. Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой. Отбирают аликвоты стандартных растворов, упаривают их на ротационном испарителе при температуре не более 40 — 45 °C. Дорамектин переводят во флюоресцирующее производное, хроматографируют в трех повторностях (объем пробы 10 куб. мм) (п. 2.6). Строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации дорамектина в мг/куб. см.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят при смене колонки и/или предколонки; при замене стандартного образца и/или реактивов после проведения ремонта; после длительного простоя хроматографа (2 недели и более).

2.7.2. Оформление результатов. Содержание дорамектина можно рассчитать по градуировочному графику или методом внешнего стандарта. В последнем случае для расчетов используют стандартный раствор, площадь пика которого наиболее близка к площади пика дорамектина в образце. Для расчета по методу внешнего стандарта используют формулу:

                              V    x V   x C   x S
                               обр    ст    ст    х

X = 400 ---------------------,

                                     V  x S
                                      х    ст

где: X — содержание дорамектина в пробе, мг/кг; C — содержание дорамектина в стандартном растворе, мг/куб. см; ст S — площадь пика дорамектина в анализируемом образце; х S — площадь пика стандарта; ст V — объем аликвоты стандартного раствора дорамектина, куб. см; ст V — объем образца (0,5 куб. см); обр V — объем образца, введенный в хроматограф (0,005 — 0,02 куб. см). х

3. Оперативный контроль результатов измерений

3.1 Контроль повторяемости результатов определения

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

                       2 x |X  - X | x 100
                             1    2

------------------- <= дельта,

                            (X  + X )
                              1    2

где:

    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2

дельта — предел относительной погрешности (табл. 1), в %.

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

4. Требования техники безопасности

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

5. Требования к квалификации операторов

Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области газожидкостной хроматографии и санитарной химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1 — 2 класса опасности, органическими растворителями, а также с правилами безопасности при работе в химической лаборатории (п. 3).

6. Условия измерений

Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1 — 2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.

---