МУК 4.1.2479-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)
Примечание
Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (Решение Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 № 880). Документ введен в действие со 2 февраля 2009 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
2 февраля 2009 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕНТАХЛОРФЕНОЛА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
МУК 4.1.2479-09
с момента утверждения
1. Разработаны ГУ НИИ питания РАМН.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 года.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в пищевых продуктах массовых концентраций пентахлорфенола (ПХФ) в диапазоне 0,005 — 1,0 мг/кг.
Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.
Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.
1. Краткая характеристика пентахлорфенола
Общепринятое название: пентахлорфенол (ПХФ).
Название по номенклатуре ИЮПАК: 2,3,4,5,6-пентахлорфенол.
Синонимы: пентахлорфенол, 1-гидроксипентахлорбензол, хлорофен, пенхлорол, пента.
Структурная формула (не приводится).
Физические свойства: белый или слегка коричневатый порошок, с характерным фенольным запахом, температура плавления 190 °C, температура кипения 310 °C, плотность D 1,978 г/куб. см, константа диссоциации рКа 4,7. Растворим в большинстве органических растворителей: ацетон (500 г/л), бензол (150 г/л), этанол (1200 г/л), метанол (1800 г/л); малорастворим в воде (2 г/л). Растворим в маслах.
Область применения. ПХФ используют в качестве фунгицида, бактерицида, гербицида, инсектицида, а также как консервант древесины.
Токсичность. Высоко токсичное соединение: при оральном введении крысам LD составляет 27 мг/кг. При контакте с кожей появляются белые пятна;
50 ингаляция вызывает сильную головную боль, усталость, утомляемость, потливость, жажду, обмороки, повышение температуры тела.
Гигиенические нормативы. Согласно европейским стандартам содержание ПХФ в воде не должно превышать 9,0 нг/л (WHO, 2001). Установленное U.S.EPA суточное потребление при оральном поступлении ПХФ, вызывающее минимальный риск для здоровья человека, составляет 0,005 мг/кг/сутки, а при хроническом его потреблении — 0,001 мг/кг/сутки.
Рекомендуемый гигиенический норматив для Российской Федерации: содержание пентахлорфенола в пищевых продуктах не допускается (на уровне предела обнаружения метода).
2. Методика определения ПХФ в продуктах питания методом газожидкостной хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1. Принцип метода. Методика основана на определении ПХФ в продуктах питания методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием электронозахватного детектора (ЭЗД) после экстракции ПХФ из подкисленной анализируемой пробы органическим растворителем, переэкстракции ПХФ в водную фазу при подщелачивании, подкислении пробы и вновь экстракции ПХФ органическим растворителем. Количественное определение проводится методом внутреннего стандарта после метилирования диазометаном. В качестве внутреннего стандарта используется альдрин.
2.1.2. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций ПХФ в пробе.
| Метрологические характеристики | Концентрация ПХФ в пробе | |
| 0,01 — 0,5 мг/кг | > 0,5 мг/кг | |
| Границы относительной погрешности (показатель точности) (+/- дельта), %, P = 0,95 | +/- 18,18 | +/- 13,09 |
| Стандартное отклонение повторяемости (сигма ), мг/кг r | 0,005 | 0,139 |
| Предел повторяемости (r), мг/кг | 0,013 | 0,385 |
| Предел обнаружения, мг/кг | 0,001 | |
| Полнота извлечения веществ, % | 75,8 | 88,3 |
Примечание. Метрологические характеристики рассчитаны для образцов с содержанием пентахлорфенола 0,02 мг/кг и 1,0 мг/кг.
2.2. Реактивы
н-Гексан, х.ч. ТУ 6-09-4521-84 Этиловый эфир ГОСТ 84-2006-88 Трихлорметан, х.ч. ТУ 6-09-4263-76
Гидразин-гидрат, ч.д.а. ГОСТ 5832-65
Тетраборат натрия, декагидрат, ч. ГОСТ 8429-77
Натрий сульфат безводный, х.ч. ГОСТ 4166-76
Кислота серная, х.ч., концентрацией 17,91 моль/л ГОСТ 4204-77
Вода дистиллированная ГОСТ 6709
Пентахлорфенол «PolyScience Corporation», США
ГСО 7296-96 альдрина, Государственный инженерный центр «РЕАКТИВ», стандартный образец в ацетоне концентрацией 0,1 мг/мл.
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Газовый хроматограф с детектором электронного захвата и инжектором с делением потока «split-splitless injector» для капиллярной колонки
Капиллярная колонка с жидкой фазой DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или HP-5, длина колонки 30 — 50 м, внутренний диаметр колонки 0,2 — 0,32 мм, толщина пленки жидкой фазы 2 — 5 мкм
Система ГЖХ-МС: масс-спектрометр Polaris-Q фирмы Finnigan (США)
Интегратор или другой регистрирующий прибор
Баллон с сжатым азотом квалификации ос.ч.
Микрошприцы МШ-10 и аналогичные (Hamilton, США)
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С ТУ 64-1-2451-78 Центрифуга ОПн-8УХЛ 4.2 ТУ 5.375-4261-76
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и погрешностью +/- 0,0001 г ГОСТ 24104
Ротационный испаритель ИР-1М или аналогичный ТУ 25-11-917
Воронка делительная на 100 куб. см ГОСТ 10054
Колбы мерные наливные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 1-1000-2 ГОСТ 1770
Колбы плоскодонные с конусом 14/23 вместимостью 100 куб. см ГОСТ 25336
Цилиндры вместимостью 100 куб. см ГОСТ 1770
Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 ГОСТ 29227
Вайл (емкость вместимостью 4 — 6 куб. см с герметично завинчивающейся крышкой)
Фильтры обеззольные ФО-ФС-15 «синяя лента» ТУ 2642-001-42624157-98
Фильтры капроновые марки 0,45 мкм RC
Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных в МУК.
2.4. Отбор проб
Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.
Перед анализом пробу образца перемалывают на мясорубке или в кофемолке и тщательно перемешивают в блендере.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1. Приготовление стандартных растворов ПХФ. Навеску 0,0025 +/- 0,0001 г кристаллического ПХФ количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, растворяют в 150 куб. см гексана, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в гексане с массовой долей ПХФ 0,01 мг/куб. см.
Для получения рабочих стандартных растворов последовательно разбавляют основной стандартный раствор гексаном. Для этого аликвоты 5,0, 2,0, 1,0 и 0,1 куб. см помещают в мерные колбы вместимостью 100 куб. см и растворы доводят гексаном до метки; получают рабочие стандартные растворы с содержанием ПХФ 0,0005, 0,0002, 0,0001 и 0,00001 мг/куб. см соответственно.
Основной и рабочие стандартные растворы ПХФ хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0 °C). Сроки годности основного и рабочих стандартных растворов год.
2.5.2. Получение диазометана. Диазометан получают по следующей методике. В реакционную колбу прибора (рис. 1 — здесь и далее рисунки не приводятся) помещают 6 г гидроксида калия, добавляют 3 куб. см метанола и 3 куб. см гидразин гидрата. В приемную колбу наливают 50 куб. см диэтилового эфира. При включенной через холодильник воде из воронки прикапывают со скоростью 1 капля за 1 — 2 с хлороформ. Окончание реакции получения диазометана определяют по появлению белых паров или бурой окраски реакционной смеси. Эфирный раствор диазометана интенсивно-желтого цвета хранят в герметично закрытой темной стеклянной посуде на холоде в течение 3 — 5 дней.
2.5.3. Приготовление рабочих стандартных растворов метиловых эфиров ПХФ. По 0,5 куб. см рабочих стандартных растворов ПХФ помещают в вайлы, растворитель упаривают досуха в токе азота, к остатку добавляют по 1,0 куб. см насыщенного раствора диазометана в эфире.
Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15 — 20 мин., после обесцвечивания растворы досуха упаривают в токе азота и остаток растворяют в 0,2 куб. см гексана. Полученный раствор используют для построения калибровочной кривой (рис. 2).
2.5.4. Приготовление калибровочной смеси стандартных растворов метилового эфира ПХФ и альдрина (внутренний стандарт). 1 куб. см ГСО альдрина помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор альдрина концентрацией 0,0001 мг/куб. см.
В вайл помещают 0,5 куб. см рабочего стандартного раствора ПХФ концентрацией 0,0001 мг/куб. см (50 нг). Растворитель упаривают досуха в токе азота, к сухому остатку добавляют 1,0 куб. см насыщенного раствора диазометана в эфире. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15 — 20 мин., после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота, к сухому остатку добавляют 0,2 куб. см стандартного раствора альдрина (20 нг) и растворитель вновь упаривают в токе азота досуха. Полученный остаток растворяют в 0,2 куб. см гексана. Полученный раствор используют для калибровки хроматографа.
2.5.5 Подготовка пробы пищевого продукта для анализа.
2.5.5.1. Приготовление 0,1 М раствора тетрабората натрия. Навеску 38,12 +/- 0,01 г тетрабората натрия декагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения соли, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Получают раствор буры концентрацией 0,1 М.
2.5.5.2. Приготовление 3,0 М раствора серной кислоты. Мерную колбу вместимостью 100 куб. см до половины заполняют дистиллированной водой. Добавляют 16,75 куб. см концентрированной серной кислоты, раствор взбалтывают, доводят до комнатной температуры и водой доводят до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор серной кислоты концентрацией 3,0 М.
2.5.5.3. Подготовка образца. Навеску 1,0 г +/- 0,01 измельченного и перемешанного в блендере образца пищевого продукта помещают в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 10 куб. см дистиллированной воды, 10 куб. см концентрированной серной кислоты и 10 куб. см смеси гексан-изопропанол (4:1). Смесь встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин., переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют 15 мин. при 2000 об./мин. и отделяют органический супернатант. Экстракцию повторяют дважды с 10 куб. см смеси гексан-изопропанол (4:1) при встряхивании и центрифугировании. Гексановые экстракты объединяют.
Объединенный гексановый экстракт помещают в делительную воронку вместимостью 100 куб. м, добавляют 10 куб. м 0,1 М раствора тетрабората натрия (бура) и смесь встряхивают. Отделяют водную фазу и экстракцию повторяют еще дважды по 10 куб. м раствора буры. Объединенный водный экстракт, при необходимости, центрифугируют и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. м, подкисляют 3 куб. м 3 М раствора серной кислоты и ПХФ экстрагируют гексаном 3 раза по 10 куб. м. Гексановый экстракт объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия, порциями фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента» или, при необходимости, фильтруют через нейлоновый фильтр в вайл и растворитель упаривают досуха в токе азота.
2.5.5.4. Получение метилового производного ПХФ из экстракта пищевого продукта. К полученному сухому остатку добавляют по 1,0 куб. м насыщенного раствора диазометана в эфире.
Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15 — 20 мин., после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота. К сухому остатку добавляют 0,2 куб. см стандартного раствора альдрина концентрацией 0,0001 мг/куб. см (20 нг, внутренний стандарт), растворитель вновь упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,2 куб. см гексана.
2.6. Описание определения
2.6.1. Условия ГЖХ анализа. Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.
Условия ГЖХ: кварцевая капиллярная колонка 50 м, внутренний диаметр 0,32 мм, жидкая фаза полиметилфенилсилоксана (5% фенила) DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или HP-5:
температура испарителя 280 °C;
время выхода растворителя 2,5 — 3 мин. (для колонки 50 м).
2.6.2. Анализ пробы. Анализ проводят в условиях ГЖХ, описанных в п. 2.6.1.
В инжектор газового хроматографа с помощью микрошприца вместимостью 10 мкл последовательно вводят две аликвоты (около 0,0005 - 0,001 куб. см) калибровочной смеси метилового эфира ПХФ и альдрина. При использовании
метода внутреннего стандарта нет необходимости вводить в хроматограф точные
количества проб. В каждом случае регистрируют время выхода растворителя гексана и времена выхода метил-ПХФ и альдрина. Определяют относительное приведенное время удерживания (наиболее воспроизводимая величина для идентификации) и площади пиков стандарта и внутреннего стандарта (S и
ст
S ). Относительные приведенные времена удерживания определяют по вн.ст следующей формуле:
t - t
ст 0
t - t
вн.ст 0
где: t' — относительное приведенное время удерживания, мин.; t — время удерживания растворителя, мин.; 0 t — время удерживания метил-ПХФ, мин.; ст t — время удерживания альдрина, мин. вн.ст
Площадь пиков определяют по показанию интегратора.
Затем в газовый хроматограф вводят 0,0005 — 0,001 куб. см раствора, полученного по п. 2.5.5.4. При наличии пика, соответствующего
относительному приведенному времени удерживания метил-ПХФ, определяют его площадь (S ). Относительное приведенное время удерживания метил-ПХФ в
обр
зависимости от условий хроматографии может меняться в пределах 0,48 — 0,51.
Абсолютные времена удерживания ПХФ в приведенных условиях - 11,2 +/- 0,2 мин. для метилового эфира ПХФ и 20,7 +/- 0,5 - для альдрина
(внутренний стандарт) (рис. 3).
2.6.3. Подтверждение результатов определения с помощью метода ГЖХ-МС. Анализ ГЖХ-МС проводили на приборе Polaris-Q фирмы Finnigan (США) при следующих условиях: ГЖХ - капиллярная колонка длиной 30 м x 0,25 мм с неподвижной фазой DB-5 при программировании температуры: начальная
температура 60 °C, 1 мин. — 250 °C, 25 °C/мин., 1 мин. — 280 °C, 5 °C/мин.;
газ-носитель гелий - 1 мл/мин. Температура инжектора 280 °C, интерфейса ГЖХ-МС - 250 °C. Условия МС: "ионная ловушка", сканирование в режиме полного ионного тока от 39 m/z до 550 m/z. Температура ионной коробочки 250 °C. В результате исследования на хроматограмме получен пик с
+
молекулярным ионом М = 280 (70%) и фрагментами с m/z 265 (100%), 237 (82%) с соответствующими изотопными хлорсодержащими пиками.
Таким образом, масс-спектр исследуемого соединения как по библиотечному поиску, так и по правилам фрагментации соответствует метильному производному ПХФ, масс-спектр которого приведен на рис. 4.
2.7. Обработка результатов измерения
2.7.1. Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой. Хроматографируют по 0,001 куб. см каждого рабочего раствора метилового эфира ПХФ (п. 2.5.3). Хроматографирование проводят трижды и строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации ПХФ в мг/куб. см (приложение 1 — не приводится).
2.7.2 Оформление результатов. Расчет содержания ПХФ в анализируемой смеси проводят по формуле:
K x m x S
вн.ст
M = --------------, (1) S вн.ст
где: M — масса анализируемого вещества (ПХФ), мкг; m — масса введенного внутреннего стандарта (альдрин), мкг, вн.ст (0,02 мкг); S — площадь пика анализируемого вещества (ПХФ); S — площадь пика внутреннего стандарта (альдрин); вн.ст K — поправочный коэффициент вещества (метил-ПХФ) по внутреннему стандарту (альдрин) (формула 2).
Поправочный коэффициент определяют в соответствии с параметрами калибровочной смеси по следующей формуле:
m x S
вн.ст
K = ----------, (2) m x S
вн.ст
где: m — масса ПХФ, нг (50 нг); m — масса альдрина, нг (20 нг); вн.ст S — площадь альдрина; вн.ст S — площадь метил-ПХФ.
Пересчет количества ПХФ на кг исследуемого продукта проводят следующим образом:
M
M = -, 1 m
где: M — содержание ПХФ, мг/кг; 1 M — масса анализируемого вещества (ПХФ), мкг (формула 1); m — масса анализируемой пробы, г (1 г).
3. Оперативный контроль результатов измерений
3.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
Для устранения инструментальных ошибок при газовой хроматографии (постоянство температуры колонки, скорости и деления потока газа и др.) применяют метод внутреннего стандарта, в качестве которого используют вещество с близкими физико-химическими и хроматографическими характеристиками (альдрин). При анализе в каждую пробу добавляют точно известное количество альдрина. Хроматографирование проводят дважды, сравнивают отношение площади пика исследуемого вещества к площади пика внутреннего стандарта и результат считают удовлетворительным, если эта величина не превышает 5%.
Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (табл. 1):
_
Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:
|C - C | <= R, (ПХФ)1 (ПХФ)2
то среднее арифметическое принимают за результат анализа.
При превышении норматива R следует повторить измерения, используя новую пробу.
3.2. Контроль качества результатов измерений
Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья, пищевых продуктов и БАД. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют раствор стандарта ПХФ, такое количество, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 — 100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.
Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (C ) и пробы с добавкой
(ПХФ)
(C' ). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ (ПХФ) проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.
Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (C' ), пробы без добавки (C ) и величиной добавки (С ) с (ПХФ) (ПХФ) доб(ПХФ) нормативом оперативного контроля (К). Решение об удовлетворительной
погрешности принимается при выполнении следующего условия (при P = 0,95):
|C' - C - C | <= К. (ПХФ) (ПХФ) доб(ПХФ) Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле
(P = 0,90):
2 2 1/2 К = 0,84 x (ДЕЛЬТА C' + ДЕЛЬТА C ) . (ПХФ) (ПХФ)
При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.
4. Требования техники безопасности
При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
5. Требования к квалификации операторов
Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области газожидкостной хроматографии и санитарной химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1 — 2 класса опасности, органическими растворителями, а также с основными правилами безопасности при работе в химической лаборатории (п. 3).
6. Условия измерений
Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1 — 2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.
Температура окружающего воздуха должна быть от 15 до 25 °C. Относительная влажность воздуха не более 80% при 25 °C. Атмосферное давление 730 — 760 мм рт. ст. Напряжение электропитания 210 — 220 В. Частота переменного тока 45 — 50 Гц.