МУК 4.1.2476-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ипконазола в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 06.02.2009)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 29 апреля 2009 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
6 февраля 2009 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИПКОНАЗОЛА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2476-09
29 апреля 2009 года
1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 февраля 2009 г.
4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.
1. Вводная часть
Торговое наименование: Крусо МЭ.
Фирма-производитель: Кромптон Европа Лтд.
Действующее вещество: ипконазол.
Структурная формула (не приводится).
(1RS, 2SR, 5RS; 1RS, 2SR, 5SR)-2-(4-хлорбензил)-5-изоприл-1-(1H-1,2,4- триазол-1-илметил)-циклопентанол (IUPAC).
Брутто-формула: C H ClN O. 18 24 3
Ипконазол представляет собой бесцветные кристаллы.
Технический продукт состоит из смеси рацематов I (1RS, 2SR, 5RS) и II (1RS, 2SR, 5SR) с температурой плавления 88 - 90 °С. Давление пара I - -3 -3 3,58 х 10 мПа (25 °С), давление пара II - 6,99 х 10 мПа (25 °С). Растворимость в воде - 6,93 мг/куб. дм (20 °С). Не подвергается термическому разложению и гидролизу. Коэффициент распределения в системе н-октанол - вода K log P = 4,21 (25 °С).
ow
Растворимость в воде — 6,93 мг/куб. дм.
Краткая токсикологическая характеристика. Острая оральная токсичность LD для крыс 1338 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс > 2000 мг/кг. Не
50 раздражает кожу, слабо раздражает слизистую глаз кроликов. СК (48 ч) для 50 карпа 2,5 мг/куб. дм.
Область применения: фунгицид для борьбы с широким кругом болезней семян, эффективен против гельминтоспориозной пятнистости листьев и ржавчины. Рацематы I и II обладают одинаковой активностью. Механизм действия — ингибирование биосинтеза эргостерина.
Гигиенические нормативы для ипконазола в России не установлены.
2. Методика определения клокуинтоцет-мексила в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом ВЭЖХ
2.1. Основные положения
2.1.1. Область применения и принцип метода. Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств ипконазола в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,001 — 0,01 мг/кг, в почве — 0,05 — 1,0 мг/кг, в зерне хлебных злаков — 0,01 — 0,1 мг/кг и в соломе — 0,05 — 0,5 мг/кг.
Методика основана на определении ипконазола методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой на концентрирующих патронах.
2.1.2. Метрологические характеристики. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, % | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Вода | 0,001 — 0,01 | 100 | 5,6 | 15,7 | 22,0 |
| Почва | 0,05 — 0,1 | 50 | 6,8 | 19,0 | 26,6 |
| Почва | 0,1 — 1,0 | 25 | 6,5 | 18,2 | 25,5 |
| Зерно | 0,01 — 0,1 | 50 | 4,6 | 12,9 | 18,0 |
| Солома | 0,05 — 0,1 | 50 | 5,2 | 14,6 | 20,4 |
| Солома | 0,1 — 0,5 | 25 | 5,0 | 14,0 | 19,6 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Вода | 0,001 | 0,001 — 0,01 | 91,3 | 6,6 | 6,0 |
| Почва | 0,05 | 0,05 — 1,0 | 76,5 | 7,7 | 7,0 |
| Зерно | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,5 | 5,1 | 4,6 |
| Солома | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 86,2 | 6,5 | 5,9 |
2.1.3. Избирательность метода. Избирательность метода определения ипконазола достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетон, осч ТУ 6-09-3513-86 Ацетонитрил для ВЭЖХ "В-200нм", сорт 5 или хч ТУ 6-09-3534-87 Бумажные фильтры "красная лента" ТУ 6.091678-86
Вода бидистиллированная, деионизированная ГОСТ 6709-79
Диэтиловый эфир, чда ТУ 2600-00143852015-02
Ипконазол, аналитический стандарт с содержанием д.в. 97,4%
Кислота ортофосфорная, хч ГОСТ 6552-80
0,005 М водный раствор свежеперегнанный
н-Гексан, хч ТУ 2631-003-05807999-98
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил -
0,005 М H PO (55:45, по объему)
3 4
Концентрирующие патроны, заполненные силикагелем 60 (0,040 — 0,063 mm), Merck.
Varian
2.3. Приборы и посуда
Жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы «Waters» с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или «Breeze» фирмы «Waters», или аналогичный
Аналитические колонки ACQUITY UPLC BEH С-18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) и ACQUITY UPLC BEH Phenyl (150 х 3,9) мм, 4 мкм (Waters) или Spherisorb Phenyl (4,6 х 150) мм, 3 мкм (Waters) и Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters)
Баня ультразвуковая «Серьга» или аналогичная ТУ 3.836.008
Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные ГОСТ 24104-2001
Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ ТУ 1-01-0593-79
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М,
Buchi R-205, или аналогичный ТУ 25-11-917-74 Насос водоструйный ГОСТ 10696-75
Испаритель одноканальный «ПЭ-2300» для концентрирования экстрактов в токе азота
Центрифуга ОПн-8УХЛ4.2 ТУ 5.375-4261-76
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Шприц медицинский с разъемом Льюера ГОСТ 22090
PH-метр универсальный ЭВ-74 ГОСТ 22261-76
Насос водоструйный МРТУ 42 861-64 Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС ГОСТ 10384-72 Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС ГОСТ 10384-72
Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см ГОСТ 1774-74
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74
Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см ГОСТ 22292-74
Микродозаторы Ленпипет переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см
2.4. Отбор и хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна»; ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб». Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей. Органические
растворители при необходимости перед началом работы очищают, сушат и
перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с
небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения
окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором
гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом
натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом
(на 1 куб. дм ацетона 10 г KMnO и 2 г K CO ). Ацетонитрил сушат над
4 2 3
пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно
перегоняют над углекислым калием.
2.5.2. Кондиционирование колонки. Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,25 — 1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.
2.5.3. Приготовление растворов. Для приготовления 2 М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98%-ной (или 225 г 87%-ной) кристаллической H PO помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в 600 куб. см 3 4
дистиллированной воды и доводят объем до метки дистиллированной водой.
Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 2,5 мл 2 М раствора H PO вносят в мерную колбу на 1 л и доводят до метки 3 4
деионизированным бидистиллятом.
Приготовление стандартного и градуировочных растворов:
Берут точную навеску ипконазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы — смесь ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота (55:45, по объему).
Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.
При изучении полноты извлечения ипконазола используют ацетонитрильные растворы вещества.
2.5.4. Построение градуировочного графика. Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация ипконазола в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ипконазола в градуировочном растворе.
2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения. Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.
2.5.6 Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта.
2.5.6.1. Кондиционирование патрона, заполненного октадецилсиликагелем Bond Elut С18 (0,5 г), осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 3 мл ацетонитрила и воды. Элюат отбрасывают.
2.5.6.2. Кондиционирование патрона для повторной очистки экстрактов зерна и соломы, заполненного силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 3 мл гексана со скоростью 1 — 2 капли в секунду.
2.6. Проведение определения
2.6.1. Определение ипконазола в пробах воды. Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 25 куб. см пропускают через кондиционированный концентрирующий патрон, заполненный октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С и сухой остаток растворяют в 0,25 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ. 10 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.2. Определение ипконазола в пробах почвы. Образец предварительно просеянной через сито почвы массой 10 г помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см с притертой пробкой, добавляют 5 см воды и 35 куб. см ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую баню и экстрагируют ипконазол в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр «красная лента»), осадок на фильтре промывают 5 куб. см ацетона. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный по п. 2.5.6 патрон с октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Колбу ополаскивают дважды порциями по 3 мл ацетонитрила и смывы также пропускают через тот же патрон. Фильтрат отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат собирают, выпаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С) и сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.3. Определение ипконазола в пробах зерна и соломы зерновых колосовых культур. Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 10 г или измельченной на ножевой мельнице соломы массой 5 г помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см. В колбу добавляют 10 куб. см воды и 40 куб. см ацетона и экстрагируют ипконазол на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром «красная лента». Экстракцию повторяют с 30 куб. см ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин., суспензию фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до 10 куб. см дистиллированной водой. Полученный раствор переносят во фторопластовую пробирку и центрифугируют при 8 тыс. об./мин. в течение 10 мин. (или при наличии взвеси раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр «красная лента», фильтр промывают 3 мл воды и фильтраты объединяют). Дальнейшую очистку проводят на патроне Диапак С18. В кондиционированный по п. 2.5.6 патрон вносят водный раствор после центрифугирования, пробирку ополаскивают 2 куб. см воды и тоже вносят в патрон. После этого промывают патрон двумя порциями по 5 куб. см ацетонитрила. Все промывки отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 куб. см ацетона в чистую круглодонную колбу объемом 10 куб. см и отдувают ацетон в токе азота. Сухой остаток растворяют в 3 куб. см гексана и выдерживают колбочку в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Дальнейшую очистку проводят на патроне, заполненном силикагелем 60. В концентрирующий патрон, промытый 3 куб. см гексана, вносят полученный раствор. Патрон промывают два раза по 3 куб. см гексаном и 1 раз 3 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (50:50, по объему). Промывки отбрасывают. Ипконазол элюируют ацетоном двумя порциями по 5 куб. см. Ацетон удаляют из элюата током азота (с помощью испарителя одноканального). Полученный сухой остаток растворяют в 2,5 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.4. Условия хроматографирования. Ультраэффективный жидкостный хроматограф «ACQUITY» фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка 1 — ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе воды и почвы и колонка 2 — ACQUITY UPLC BEH С-18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе проб зерна и соломы. Температура колонки 30 +/- 1 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 55:45. Скорость потока элюента: 0,25 мл/мин. Рабочая длина волны: 220 нм. Объем вводимой пробы: 10 мкл. Время удерживания ипконазола: 3,3 +/- 0,1 мин. (колонка 1) и 5,3 +/- 0,1 мин. (колонка 2).
Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф «Breeze» фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны: 220 нм. Аналитическая колонка Spherisorb Phenyl (Waters) 150 х 4,6 мм, 5 мкм для анализа воды и почвы и Supelcosil С-18 (150 х 4,6) мм, 5 мкм (Sigma-Aldrich) для анализа проб зерна и соломы. Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 50:50 (pH 2,35). Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин. Дозируемый объем: 20 мкл.
3. Обработка результатов анализа
Содержание ипконазола в образцах воды, почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
S х C х V
2
где:
S - площадь пика ипконазола в стандартном растворе, (мВ х с);
1
S - площадь пика ипконазола в анализируемой пробе, (мВ х с);
2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб.
см; P — навеска анализируемого образца, г; C — концентрация стандартного раствора ипконазола, мкг/куб. см.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ипконазола 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
4. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X и X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
5. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,005 мг/кг <*>).»
<*> 0,005 мг/кг — предел обнаружения.
6. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д п,X п,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности п,X п,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:
X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: К
_ _ К = X' - X - C , К д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. п,X' п,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
К
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
7. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).
При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.
8. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.