МУК 4.1.2457-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пиноксадена по основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 01.11.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.2457-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пиноксадена по основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.2457-09. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-2457-09
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 29 апреля 2009 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
2 февраля 2009 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПИНОКСАДЕНА ПО ОСНОВНЫМ МЕТАБОЛИТАМ В ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2457-09
29 апреля 2009 года
1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.
4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пиноксадена по его основным метаболитам в зерне и соломе зерновых колосовых культур в диапазонах 0,04 — 0,4 мг/кг и 0,08 — 0,8 мг/кг соответственно.
2,2-Диметилпропионовая кислота, 8-(2,6-диэтил-4-метилфенил)-9-оксо-1,2,4,5тетрагидро-9H-пиразоло[1,2-d][1,4,5]оксадиазепин-7-ил-эфир (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
Бесцветное кристаллическое вещество, со сладковатым запахом. -7 Температура плавления 120,5 — 121,6 °С. Давление паров — 2,0 х 10 Па (при -7
20 °С), 4,6 х 10 Па (при 25 °С). Растворимость в органических растворителях при 25 °С (в г/куб. дм): ацетон - 250; дихлорметан - > 500; этилацетат - 130; метанол - 260; толуол - 130; н-октанол - 140; н-гексан -
1,0. Растворимость в воде 200 мг/куб. дм (25 °С). Коэффициент распределения н-октанол-вода — log К = 3,2. ow
Гидролитическая стабильность (DT ) при 25 °С — 17,2 дней (pH 4); 17,5 50 дней (pH 5); 9,9 дней (pH 7); 0,2 дня (pH 9).
Основными продуктами метаболитической деградации (гидролиз, окисление) пиноксадена в зерне и соломе являются соответствующий дион — метаболит 2 (здесь и далее — М2), 4-гидроксиметил-фенил-дион — метаболит 4 (здесь и далее — М4) и 4-карбоксиметил-фенил-дион — метаболит 6 (здесь и далее — М6).
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — более 5000 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов — более 2000 мг/кг; 50 острая ингаляционная токсичность (LC ) для крыс (4 ч) — 4,63 мг/куб. дм 50 (самцы), 6,24 мг/куб. дм (самки).
8-(2,6-диэтил-4-метил-фенил)-тетрагидропиразоло[1,2-d][1,4,5] оксадиазепин-7,9-дион (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
Бесцветное кристаллическое вещество, растворимость в воде — 370 мг/куб. -13
дм, давление паров - 5,2 х 10 атм. Коэффициент распределения н-октанол/вода - log K = 0,62 - 1,7.
ow
8-(2,6-диэтил-4-гидроксиметил-фенил)-тетрагидропиразоло[1,2-d][1,4,5]окса-диазепин-7,9-дион (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
4-(7,9-диоксо-гексагидро-пиразоло[1,2-d][1,4,5]окса-диазепин-8-ил)-3,5-диэтил-бензойная кислота (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
Пиноксаден рекомендуется в качестве высокоэффективного селективного послевсходового гербицида для подавления роста широкого спектра злаковых сорняков на посевах ячменя, пшеницы, ржи и тритикале.
Рекомендуемый МДУ в зерне зерновых колосовых культур — 0,1 мг/кг.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Определяемое вещество | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (куб. дм) | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R |
| Зерно | |||||
| Метаболит М2 | от 0,04 до 0,1 вкл. | 50 | 10,0 | 28 | 33 |
| более 0,1 до 0,4 | 25 | 7,3 | 20 | 24 | |
| Метаболит М4 | от 0,04 до 0,1 вкл. | 50 | 6,6 | 18 | 22 |
| более 0,1 до 0,4 | 25 | 5,0 | 14 | 16 | |
| Метаболит М6 | от 0,04 до 0,1 вкл. | 50 | 5,8 | 16 | 19 |
| более 0,1 до 0,4 | 25 | 5,9 | 16 | 20 | |
| Солома | |||||
| Метаболит М2 | от 0,08 до 0,1 вкл. | 50 | 6,6 | 18 | 22 |
| более 0,1 до 0,8 | 25 | 6,7 | 19 | 22 | |
| Метаболит М4 | от 0,08 до 0,1 вкл. | 50 | 6,4 | 18 | 21 |
| более 0,1 до 0,8 | 25 | 6,3 | 18 | 21 | |
| Метаболит М6 | от 0,08 до 0,1 вкл. | 50 | 6,1 | 17 | 20 |
| более 0,1 до 0,8 | 25 | 6,3 | 18 | 21 | |
Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.
| Определяемое | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| вещество | Предел обнаружения, мг/кг (куб. дм) | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (куб. дм) | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, % |
| Зерно | |||||
| Метаболит М2 | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 78,9 | 5,7 | +/- 3,1 |
| Метаболит М4 | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 80,0 | 3,8 | +/- 2,0 |
| Метаболит М6 | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 78,9 | 3,6 | +/- 2,0 |
| Солома | |||||
| Метаболит М2 | 0,08 | 0,08 — 0,8 | 79,1 | 4,9 | +/- 2,6 |
| Метаболит М4 | 0,08 | 0,08 — 0,8 | 79,3 | 4,1 | +/- 2,2 |
| Метаболит М6 | 0,08 | 0,08 — 0,8 | 80,2 | 4,1 | +/- 2,2 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль пиноксадена в образцах зерна и соломы осуществляется по содержанию его основных метаболитов (М2, М4 и М6) после экстракции из анализируемых образцов смесью 1 № соляная кислота — ацетонитрил (М2) или 1 № соляной кислотой (М4 и М6) при кипячении, последовательной очистки аликвоты экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, на колонке с оксидом алюминия, затем концентрирующих патронах Oazis(R) HLB (М2) или дважды Oazis(R) MCX (М4 и М6).
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым
детектором с переменной длиной волны Номер Госреестра (фирмы Perkin-Elmer, США) 15311-02
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 7328
Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-500-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см ГОСТ 29227
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 10 куб. см ГОСТ 1770
25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Метаболит 2 (NOA 407854), аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,6% (Сингента, Швейцария)
Метаболит 4 (SYN 505164), аналитический стандарт с содержанием основного вещества 86% (Сингента, Швейцария)
Метаболит 6 (SYN 502836), аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99% (Сингента, Швейцария)
Алюминий оксид, активированный, нейтральный, для колоночной хроматографии, 50 — 200 мкм («Акрос Органикс», Бельгия)
Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ 6-09-4326-76 Вода деионизованная ГОСТ 6702
Дихлорметан (хлористый метилен), хч ГОСТ 12794
Диэтиловый эфир ОСТ 84-2005-88
Кислота муравьиная, 85%, Panreac
Кислота соляная (хлороводородная), хч ГОСТ 6552
Кислота уксусная ледяная ГОСТ 61
Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995
Пропанол-2 (изопропиловый спирт), хч ТУ 6-09-402-87
Этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), хч ГОСТ 4328
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные вместимостью 500 куб. см
Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 500 куб. см
Колбы плоскодонные вместимостью 100, 250, 400 — 500 куб. см ГОСТ 9737
Колбы грушевидные на шлифе вместимостью 20 — 25, 50, 100 и 250 куб. см ГОСТ 9737
Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм
Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 10696
Стаканы химические вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336
Патроны для твердофазной экстракции Oazis(R) HLB 3cc (60 mg), WAT094226, Lot No 077B37297C (Waters, США)
Патроны для твердофазной экстракции Oazis(R) MCX 6cc (500 mg) LP, Part No 186000776, Lot No 0025376232A (Waters, США)
Плитка электрическая (или колбонагреватель)
Ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария
Установка для перегонки растворителей
Холодильник водяной обратный ГОСТ 9737
Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry(R) С18, зернением 5 мкм
Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С8, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм
Шприцы медицинские с разъемом Льюера вместимостью 5 и 10 куб. см ГОСТ 22090
Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Обучение работников соблюдению безопасности условий труда по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, смеси для экстракции, подвижных фаз для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, подготовка концентрирующих патронов Oazis(R) HLB и Oazis(R) MCX.
7.1. Очистка органических растворителей
7.1.1. Ацетонитрил. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.2. Ацетон. Растворитель сушат над молекулярными ситами 4 А и подвергают фракционной перегонке на ректификационной колонне, целиком собранной из стекла с числом теоретических тарелок не менее 30. До начала отбора главной фракции приемник несколько раз промывают дистиллятом. Перегонку продолжают до тех пор, пока в сосуде для перегонки не останется приблизительно 100 куб. см ацетона. Температуру водяной бани следует снижать по мере уменьшения объема ацетона, во всех случаях она не должна превышать температуру кипения ацетона (56 °С) более чем на 20 °С.
7.1.3. Дихлорметан. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.
7.1.4. Этилацетат. Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.
7.2. Приготовление растворов соляной кислоты
Для приготовления 1 № раствора в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, содержащую 300 — 400 куб. см деионизованной воды, помещают 82 куб. см концентрированной соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.
Для приготовления 0,2 № раствора в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см 1 № раствора соляной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.
7.3. Приготовление 10%-ного раствора хлористого натрия
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 50 г хлорида натрия, доводят водой до метки, перемешивают.
7.4. Приготовление растворов уксусной кислоты в этилацетате
Для приготовления 2%-ного раствора в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, содержащую 200 — 300 куб. см этилацетата, помещают 10 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят этилацетатом до метки, перемешивают.
Для приготовления 1%-ного раствора в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, содержащую 200 — 300 куб. см этилацетата, помещают 5 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят этилацетатом до метки, перемешивают.
7.5. Приготовление 1%-ного раствора уксусной кислоты в ацетонитриле
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см, содержащую 200 — 300 куб. см ацетонитрила, помещают 5 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят ацетонитрилом до метки, перемешивают.
7.6. Приготовление 0,2%-ного водного раствора муравьиной кислоты
В мерную колбу вместимостью 500 куб. см, содержащую 200 — 300 куб. см деионизованной воды, помещают 1 куб. см муравьиной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.
7.7. Приготовление смеси растворителей для экстракции метаболита М2
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 900 куб. см 1 № соляной кислоты и 100 куб. см ацетонитрила, перемешивают.
7.8. Подготовка концентрирующих патронов Oazis(R) HLB и Oazis(R) MCX
Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>.
<*> В отсутствие специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью поршня медицинского шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 — 2 капли в секунду.
Концентрирующие патроны промывают с помощью медицинского шприца (или разряжения, создаваемого водоструйным насосом) метанолом (объем растворителя для патронов Oazis(R) HLB — 2 куб. см, Oazis(R) MCX — 3 куб. см), затем 2 куб. см деионизированной воды (патроны Oazis(R) HLB) или дважды по 3 куб. см 0,2%-ной муравьиной кислотой (патроны Oazis(R) MCX) со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 — 2 капли в секунду. Патроны готовят непосредственно перед использованием.
7.9. Подготовка подвижной фазы № 1 для ВЭЖХ (определение метаболита М2)
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 450 куб. см деионизованной воды, 1 куб. см муравьиной кислоты, 50 куб. см изопропанола и 500 куб. см метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
7.10. Подготовка подвижной фазы № 2 для ВЭЖХ (определение метаболитов М4 и М6)
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 620 куб. см деионизованной воды, 1 куб. см муравьиной кислоты, 40 куб. см изопропанола и 340 куб. см метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
7.11. Кондиционирование хроматографических колонок
Промывают колонки подвижной фазой (приготовленной по п. 7.9 или 7.10) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.12. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения
7.12.1. Исходные растворы метаболитов М2, М4 и М6 для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,0100 г метаболита М2 или М6 (содержание основного вещества 99 и 99,6% соответственно), 0,0116 г метаболита М4 (содержание основного вещества 86%), добавляют 50 — 70 куб. см метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Растворы хранятся в холодильнике в течение 3-х месяцев.
Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.
7.12.2. Растворы № 1 метаболитов М2, М4 и М6 для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора метаболитов М2, М4 или М6 с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.12.1), разбавляют метанолом до метки, перемешивают. Растворы хранятся в холодильнике в течение месяца.
Растворы метаболитов с концентрацией 10 мкг/куб. см используют для приготовления проб зерна и соломы с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.
7.12.3. Рабочие растворы № 2 — 5 метаболитов М2, М4 и М6 для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.12.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.9 или 7.10, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией метаболитов М2, М4 или М6 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в холодильнике в течение 7-ми дней.
7.13. Установление градуировочных характеристик
Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика (мкВ х с) от концентрации метаболитов М2, М4 или М6 в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.1 или 9.3.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
7.14. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта
Приготовление оксида алюминия 3-й степени активности по Брокману: 100 г сорбента (алюминий оксид, активированный, нейтральный) помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 куб. см, с помощью пипетки по каплям вносят в колбу 4,6 куб. см деионизованной воды (после каждой капли встряхивая колбу для равномерного распределения жидкости по объему сорбента). Закрывают колбу пробкой, интенсивно встряхивают в течение 4 — 5-ти минут, затем оставляют на 12 часов, периодически перемешивая (встряхиванием).
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, через воронку насыпают в колонку 5 г приготовленного сорбента, уплотняют его (при открытом кране) постукиванием резиновой грушей о стенки. Промывают колонку 15 — 20 куб. см этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.
7.15. Проверка хроматографического поведения метаболита М2 на колонке с оксидом алюминия
В круглодонную колбу вместимостью 20 — 25 куб. см помещают 0,2 куб. см раствора № 1 для градуировки и внесения с концентрацией М2 10 мкг/куб. см (п. 7.12.2), растворитель упаривают досуха, добавляют 5 куб. см этилацетата, перемешивают (помещая на ультразвуковую баню на 20 — 30 с) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.14. Промывают колонку со скоростью 1 — 2 капли в секунду последовательно 20 куб. см этилацетата (первыми 5 куб. см предварительно ополаскивают колбу, в которой находилась проба), 10 куб. см смеси этилацетат — метанол (90:10, по объему), затем 50 куб. см смеси этилацетат — метанол (50:50, по объему), элюат отбрасывают.
Затем колонку промывают 40 куб. см смеси метанол — 1%-ная уксусная кислота в этилацетате (50:50, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Фракционно (по 5 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.9, анализируют содержание метаболита М2 по п. 9.3.1.
Фракции, содержащие М2, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
7.16. Проверка хроматографического поведения метаболитов М4 и М6 на колонке с оксидом алюминия
В круглодонную колбу вместимостью 20 — 25 куб. см помещают по 0,05 куб. см исходных растворов метаболитов М4 и М6 для градуировки с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.12.1), добавляют 5 куб. см этилацетата, перемешивают (помещая на ультразвуковую баню на 20 — 30 с) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.14. Промывают колонку со скоростью 1 — 2 капли в секунду 50 куб. см этилацетата (первыми 5 куб. см предварительно ополаскивают колбу, в которой находилась проба), элюат отбрасывают.
Затем колонку промывают 100 куб. см 2 %-ной уксусной кислоты в этилацетате со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.10, анализируют содержание метаболитов М4 и М6 по п. 9.3.2.
Фракции, содержащие метаболиты М4 и М6, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень веществ в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Проверку хроматографического поведения веществ следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.
8. Отбор и хранение проб
Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», ГОСТ Р 50436-92 «Зерновые. Отбор проб зерна», ГОСТ 27262-87 «Корма растительного происхождения. Методы отбора проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Зерно и солому подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в тканевых мешочках в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Измельченные пробы зерна и соломы (аналитические образцы массой 10 г и 5 г соответственно) замораживают и хранят при температуре -18 °С.
Перед анализом зерно и солому измельчают.
9. Выполнение определения
9.1. Определение метаболита М2
9.1.1. Экстракция. Образец измельченного зерна массой 10 г или соломы массой 5 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 куб. см, вносят 200 куб. см смеси 1 № соляная кислота — ацетонитрил (90:10, по объему), колбу подсоединяют к обратному холодильнику и помещают на кипящую водяную баню на 2 ч, по окончании процесса охлаждают.
Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре не промывают. Аликвоту экстракта объемом 100 куб. см (эквивалентную 5 г зерна или 2,5 г соломы) переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см. Далее проводят очистку по п. 9.1.2.
9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей. В делительную воронку, содержащую аликвоту экстракта, полученную по п. 9.1.1, вносят 50 куб. см 10%-ного раствора хлористого натрия, перемешивают, добавляют 40 куб. см этилацетата, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. Оставляют до полного разделения фаз на 30 — 40 мин. (для облегчения расслаивания целесообразно поместить пробу в холодильник, а также потирать стеклянной палочкой по стенкам воронки в месте соприкосновения фаз). После полного разделения фаз нижний водный слой отделяют, перенося в коническую колбу на 200 — 250 куб. см, верхний органический слой осторожно переносят (через верх воронки) в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см (не допуская попадания в нее капель воды <*>). Водную фазу возвращают в делительную воронку, и операцию экстракции этилацетатом повторяют еще дважды порциями растворителя по 40 куб. см. Объединенный этилацетатный экстракт упаривают при температуре 35 °С на ротационном вакуумном растворителе досуха. Для полного удаления следов влаги в колбу вносят 5 — 10 куб. см ацетонитрила и вновь упаривают. Остаток в колбе подвергают очистке на колонке по п. 9.1.3.
<*> Использование безводного сульфата натрия для осушения экстракта недопустимо, поскольку это ведет к полной потере вещества.
9.1.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия. Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 5 куб. см этилацетата (при образовании осадка раствор фильтруют через тампон из стекловаты, помещенный в носик химической воронки) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.14. Колбу обмывают трижды порциями этилацетата по 3 — 4 куб. см (в совокупности 10 куб. см), которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 10 куб. см этилацетата, 10 куб. см смеси этилацетат — метанол (90:10, по объему) и 50 куб. см смеси этилацетат — метанол (50:50, по объему), элюат отбрасывают. Метаболит М2 элюируют с колонки 30 куб. см смеси метанол — 1%-ная уксусная кислота в этилацетате (50:50, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, первые 5 куб. см отбрасывают, последующие 25 куб. см собирают в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха (полное отсутствие запаха уксусной кислоты и этилацетата) при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют в 6 куб. см деионизованной воды, помещая на ультразвуковую баню на 20 — 30 с, и очищают на концентрирующем патроне по п. 9.1.4.
9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Oazis HLB. Пробу, полученную по п. 9.1.3, вносят с помощью медицинского шприца (или разряжения, создаваемого водоструйным насосом) на концентрирующий патрон Oazis HLB 3cc(60 mg), подготовленный по п. 7.8, со скоростью пропускания раствора 1 — 2 капли в секунду. После нанесения пробы патрон промывают 2 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:9, по объему), пропуская растворитель до нижнего края сорбента, элюаты отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 3 куб. см ацетонитрила, собирая элюат в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 20 — 25 куб. см. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.9 (помещая на ультразвуковую баню на 20 — 30 с), и анализируют содержание метаболита М2 по п. 9.3.1.
9.2. Определение метаболитов М4 и М6
9.2.1. Экстракция. Образец измельченного зерна массой 10 г или соломы массой 5 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 500 куб. см, вносят 200 куб. см 1 № соляной кислоты, колбу подсоединяют к обратному холодильнику и помещают на кипящую водяную баню на 2 ч, по окончании процесса охлаждают.
Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре не промывают. Аликвоту экстракта объемом 100 куб. см (эквивалентную 5 г зерна или 2,5 г соломы) переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см. Далее проводят очистку по п. 9.2.2.
9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей. В делительную воронку, содержащую аликвоту экстракта, полученную по п. 9.2.1, вносят 40 куб. см смеси дихлорметан — диэтиловый эфир — ацетон (40:7:3, по объему), интенсивно встряхивают воронку в течение 2 мин. Оставляют до полного разделения фаз на 30 — 40 мин. (для облегчения расслаивания целесообразно поместить пробу в холодильник, а также потирать стеклянной палочкой по стенкам воронки в месте соприкосновения фаз). После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, перенося в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см (не допуская попадания в нее капель воды из воронки). Операцию экстракции водной фазы смесью дихлорметан — диэтиловый эфир — ацетон (40:7:3, по объему) повторяют еще дважды порциями по 30 куб. см. Объединенный экстракт упаривают при температуре 35 °С на ротационном вакуумном растворителе досуха. Для полного удаления следов влаги в колбу вносят 5 — 10 куб. см ацетонитрила и вновь упаривают. Остаток в колбе подвергают очистке на колонке по п. 9.2.3.
9.2.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия. Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 5 куб. см этилацетата (при образовании осадка раствор фильтруют через тампон из стекловаты, помещенный в носик химической воронки) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.14. Колбу обмывают трижды порциями этилацетата по 3 — 4 куб. см (в совокупности 10 куб. см), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 40 куб. см этилацетата, элюат отбрасывают. Метаболиты М4 и М6 элюируют с колонки 100 куб. см 2%-ной уксусной кислоты в этилацетате со скоростью 1 — 2 капли в секунду, первые 10 куб. см элюата отбрасывают, последующие 90 куб. см собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Раствор упаривают досуха (полное отсутствие запаха уксусной кислоты и этилацетата) при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют в 25-ти куб. см 0,2 № соляной кислоты, помещая на ультразвуковую баню на 20 — 30 с, и очищают на концентрирующих патронах по п. 9.2.4.
9.2.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Oazis MCX. Пробу, полученную по п. 9.2.3, вносят с помощью медицинского шприца (или разряжения, создаваемого водоструйным насосом) на концентрирующий патрон Oazis MCX 6cc(500 mg), подготовленный по п. 7.8, со скоростью пропускания раствора 1 — 2 капли в секунду, пропуская раствор до нижнего края сорбента. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см смеси метанол — вода (20:80, по объему), затем 25 куб. см 1%-ной уксусной кислоты в ацетонитриле, каждый раз пропуская растворитель до нижнего края сорбента, элюаты отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 25 куб. см смеси ацетонитрил — 0,2%-ная муравьиная кислота (50:50, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 100 куб. см. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С досуха. Вносят в колбу 25 куб. см 0,2 № соляной кислоты, помещают на ультразвуковую баню на 20 — 30 с. Затем операцию очистки на патроне Oazis MCX повторяют. Пробу вносят с помощью медицинского шприца (или разряжения, создаваемого водоструйным насосом) на новый концентрирующий патрон Oazis MCX 6cc(500 mg) со скоростью пропускания раствора 1 — 2 капли в секунду, пропуская раствор до нижнего края сорбента. После нанесения пробы патрон промывают 5 куб. см смеси метанол — вода (20:80, по объему), затем 25 куб. см 1%-ной уксусной кислоты в ацетонитриле, каждый раз пропуская растворитель до нижнего края сорбента, элюаты отбрасывают. Вещества элюируют с патрона 25 куб. см смеси ацетонитрил — 0,2%-ная муравьиная кислота (50:50, по объему), собирая элюат в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 100 куб. см. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.10 (помещая на ультразвуковую баню на 20 — 30 с), и анализируют содержание метаболитов М4 и М6 по п. 9.3.2.
9.3. Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
Жидкостный хроматограф «Breeze» с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США)
Температура колонки комнатная Скорость потока элюента 0,1 куб. см/мин. Рабочая длина волны 254 нм Объем вводимой пробы 20 куб. мм Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг.
9.3.1. Определение метаболита М2. Хроматографическая колонка стальная длиной 25 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С8, зернением 5 мкм
Подвижная фаза изопропанол — вода — муравьиная кислота (50:5:45:0,1, по объему)
Ориентировочное время выхода метаболита М2 10,2 — 10,9 мин.
9.3.2. Определение метаболитов М4 и М6. Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С8, зернением 5 мкм
Подвижная фаза метанол — изопропанол — вода — муравьиная кислота (34:4:62:0,1, по объему)
Ориентировочное время выхода: М4: 9,0 — 9,3 мин.
Для достоверности идентификации метаболитов их детектирование возможно при длине волны 268 нм, поскольку в данной области интенсивность поглощения веществ (М2, М4, М6) ~= в 2,5 раза ниже, чем при 254 нм. Соблюдение соотношения площадей пиков при этих волнах подтверждает наличие остаточных количеств метаболитов пиноксадена в пробе.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижными фазами, приготовленными по п. 7.9 или 7.10 (не более чем в 50 раз).
10. Обработка результатов анализа
Содержание пиноксадена в пробе зерна и соломы по его основным метаболитам М2, М4 и М6 в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
(Б х К1 + В х К2 + Г х К3) х V х С
X = ----------------------------------, m
Б, В, Г — концентрации метаболитов М2, М4 и М6 соответственно, найденные по градуировочным графикам, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г;
С = 2 с учетом объема экстракта, взятого для анализа;
К1, К2 и К3 — коэффициенты пересчета содержания метаболита М2, М4 и М6 на эквивалент пиноксадена по соотношению молекулярных масс (равны 1,266, 1,205 и 1,456 соответственно).
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде: _
(X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где:
_
X - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
X
где:
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.
Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе зерна менее 0,04 мг/кг, соломы — менее 0,08 мг/кг» <*>.
<*> 0,04 мг/кг и 0,08 мг/кг — пределы обнаружения в зерне и соломе соответственно.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
X
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = X' - X - С , к д _ _ где X', X, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |X - X | х 100
1 2
(X + X )
1 2
где:
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
таблица 1), %.
14. Разработчики
Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.