МУК 4.1.2455-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств каптана в яблочном соке методом газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)

2 февраля 2009 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАПТАНА В ЯБЛОЧНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

29 апреля 2009 года

1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. № 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 года.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 года.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств каптана в яблочном соке в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.

Краткая характеристика препарата

Название действующего вещества по ИСО: каптан.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 1,2,5,6-тетрагидро-N-трихлорметилтиофталимид.

Структурная формула (не приводится).

C H Cl NO S 9 8 3 2

Мол. масса: 300,6.

Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.

Цвет, запах: белое вещество, почти без запаха.

Температура плавления: 178 °C.

Летучесть (давление паров): < 1,3 мПа (при 25 °C).

    Растворимость:  в  воде  3,3  мг/куб. дм  (при 25 °C);  в  органических
растворителях  при  26 °C  (г/куб.  дм):  ксилоле  -  20;  толуоле  -  6,9;
хлороформе - 70;  ацетоне  -  21,  циклогексаноне  -  23;  диоксане  -  47;
бензоле - 21;  изопропаноле - 1,7;  этаноле - 2,9;  диэтиловом эфире - 2,5.
Коэффициент перераспределения в системе октанол:вода: K   log P - 2,8.

                                                   ow

    Стабильность в водных растворах:  медленно  гидролизуется в нейтральной
среде,  быстро разрушается в щелочной  среде: DT   - 32,4 ч (pH 5);  DT   -
                                                50                     50
8,3 ч (pH 7), < 2 мин. (pH 10).  Разрушается  при нагревании до температуры

плавления.

Краткая токсикологическая характеристика

Каптан относится к малоопасным веществам по острой оральной (ЛД для 50 крыс — 9000 мг/кг), дермальной (ЛД для кроликов — более 4500 мг/кг), но к 50 опасным по ингаляционной токсичности (ЛК для крыс — 668 мг/куб. м). Может 50 вызывать раздражение кожи с сенсибилизацией и слизистых оболочек глаз, имеются ограниченные сведения о канцерогенном эффекте в опытах на животных.

В России для каптана установлены следующие гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов санитарно-бытового пользования — 0,2 мг/куб. дм; в воде рыбохозяйственных водоемов — 0,0006 мг/куб. дм; в почве — 1 мг/кг; в воздухе рабочей зоны — 0,3 мг/куб. м.

МДУ в продукции (мг/кг): содержание вещества в овощах, фруктах, ягодах, винограде, картофеле, бахчевых культурах не допускается.

Область применения

Каптан — не системный фунгицид с защитным и лечебным действием. Используется путем опрыскивания в период вегетации для борьбы с болезнями яблони и груши (парша), косточковых (кластероспориоз), земляники (пятнистость), картофеля и томатов (фитофтороз и альтернариоз) и других культур. Нормы расхода (в кг/га) на яблоне и груше 3,75 — 5; на абрикосах, вишне, персиках, сливе, черешне 2,5 — 3,5; на малине, крыжовнике, смородине 1,5 — 1,75; на томатах и картофеле, бахчевых 1,5 — 2; на землянике (до цветения и после сбора урожая) 1,25; на виноградной лозе 2,5 — 3,75.

1. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, % P = 0,95	Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
Яблочный сок	0,01 — 0,1	50	3,35	9	11

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определимых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	доверительный интервал среднего результата, +/-, %
Яблочный сок	0,01	0,01 — 0,10	86,11	0,75	1,35

2. Метод измерений

Метод основан на определении каптана методом газожидкостной хроматографии с использованием детектора постоянной скорости рекомбинации электронов после экстракции данных веществ из исследуемой пробы ацетонитрилом и очистки экстракта путем перераспределения в несмешивающихся жидкостях и с помощью колоночной хроматографии на флоризиле.

Идентификацию вещества проводят по времени удерживания путем сравнения с аналитическим стандартом, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора колонки и изменения температуры колонки.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1. Средства измерений

Весы аналитические СИГМА 11140 с пределом допустимой погрешности +/- 0,0001 г, фирма «OHAUS»

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г V600, «ACCULAB»

Колбы мерные вместимостью 10, 50 и 100 куб. см ГОСТ 1770-74

Микрошприц Гамильтон вместимостью 10 куб. мм

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см ГОСТ 20292-74

Хроматограф газовый «Кристалл 2000м» с термоионным детектором (ТИД) с пределом -13 детектирования по азоту в азобензоле 5 x 10 г/куб. см и приспособлениями для капиллярной колонки

Цилиндры мерные 2-го класса точности

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Аналитический стандарт каптана, содержание основного вещества 98,7%, фирмы Мактешим Аган Индастриз Лтд

Азот особой чистоты ГОСТ 9293

Ацетонитрил, х.ч.                                        ТУ 6-09-06-1092-83
Вода дистиллированная                                    ГОСТ 7602-72
Гексан, ч.                                               ТУ 6-09-3375

Натрий хлористый, ч.д.а., водный раствор массовой концентрации 40 г/куб. дм ГОСТ 4233

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 — 80 меш, фирма «Агрос Органикс», Бельгия, код 205450010

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Аппарат для встряхивания проб TYP LT1 фирмы «SKLO UNION»

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, NALGENE

Воронки химические для фильтрования, стеклянные          ГОСТ 8613-75
Воронки делительные на 250 куб. см                       ГОСТ 10054-75
Испаритель ротационный вакуумный ИР-1М                   ТУ 25-11917

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480

Концентраторы грушевидные на 100 и 250 куб. см, НШ 29 КГУ-100 (250) ГОСТ 10394-72

Колонка хроматографическая, капиллярная кварцевая HP-5 длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма J&W Scientific

Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport

Фильтры бумажные «красная лента» ТУ 6-09-2678-77

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газожидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на газожидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению определений

7.1. Подготовка растворителей

Все растворители используют свежеперегнанными. Перегонку растворителей проводят, строго отбирая фракцию, соответствующую по температуре кипения основному веществу.

7.2. Приготовление стандартных и градуировочных растворов каптана

Основной раствор каптана готовят, количественно перенося навеску вещества массой по 100 мг в мерные колбы вместимостью 100 куб. см. В колбы вносят 20 куб. см ацетона, содержимое колб перемешивают до полного растворения кристаллов каптана. Объем раствора в колбах доводят до метки ацетоном, после чего содержимое колб тщательно перемешивают. Получают раствор каптана массовой концентрации 1 мг/куб. см (раствор № 1), который может храниться не более 1 месяца.

Методом последовательного разбавления раствора № 1 ацетоном в мерных колбах готовят рабочие растворы с концентрациями каптана 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см, которые могут храниться в холодильнике не более 10 суток.

Основной и градуировочные растворы каптана хранят в холодильнике.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации каптана в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по стандартным растворам с концентрациями 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора каптана и хроматографируют в условиях п. 9.2. Проводят не менее 3 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации каптана в растворе в мкг/куб. см.

7.4. Подготовка колонки для очистки экстракта

В пластмассовую колонку длиной 15 см, диаметром 1,5 см помещают на дно чистую стекловату и заполняют колонку 5 г флоризила 60/100 меш, уплотняя его путем вибрации колонки. На слой флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см. Флоризил в колонке промывают 15 куб. см ацетона, ацетон под давлением удаляют из колонки. Затем колонку промывают 15 куб. см гексана.

7.5. Проверка хроматографического поведения каптана на колонке для очистки экстракта

Хроматографическое поведение каптана проверяют каждый раз при использовании новой партии флоризила. В стаканчик помещают 1 куб. см стандартного раствора каптана с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, добавляют 9 куб. см гексана, перемешивают содержимое и наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 10 куб. см гексана и 5 куб. см смеси гексан-ацетон — 4:1, смывы отбрасывают.

Пропускают через колонку 4 порции смеси гексан-ацетон (1:1) по 5 куб. см каждая, собирая их в отдельные концентраторы. Собранные фракции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм пробы. Фракции, содержащие каптан, объединяют, выпаривают досуха, сухой остаток вновь растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм пробы. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва с колонки и необходимый для очистки объем элюата.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», N 2051-79 от 21.08.79, а также с ГОСТ 656-76 — «Плодовый сок, ТУ».

Пробы соков хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре +4 °C не более 10 суток.

9. Выполнение определения

9.1. Яблочный сок

9.1.1. Экстракция каптана из анализируемой пробы и предварительная очистка. Навеску сока 10 г разводят 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку. Добавляют в воронку 50 куб. см ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение 1 — 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой переливают в стаканчик, а слой ацетонитрила — в концентратор емкостью 250 куб. см. Водную фракцию из стаканчика переносят в делительную воронку, добавляют в воронку 30 куб. см ацетонитрила и экстрагируют каптан, как указано выше. Экстракцию повторяют еще раз с тем же объемом ацетонитрила.

    Объединенный экстракт  ацетонитрила выпаривают на ротационном вакуумном
испарителе   при  температуре  35 °C  до  объема  1 - 2 куб. см.  Остаток в
концентраторе  разводят   100 куб.  см  2%  раствора  Na SO   и переносят в
                                                        2  4

делительную воронку емкостью 250 куб. см.

Добавляют в воронку 30 куб. см хлористого метилена и встряхивают воронку в течение 1 — 2 мин. После разделения слоев нижний слой хлористого метилена сливают в концентратор, пропуская через безводный сернокислый натрий. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см хлористого метилена. Хлористый метилен выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе.

9.1.2. Очистка экстракта на колонке с флоризилом. Сухой остаток в концентраторе разводят в 1 куб. см ацетона, добавляют 9 куб. см гексана, обмывают смесью стенки концентратора и переносят его содержимое на колонку с флоризилом. Колонку промывают последовательно 10 куб. см гексана и 5 куб. см смеси гексан-ацетон — 4:1, смывы отбрасывают. Фолпет элюируют с колонки 15 куб. см смеси гексан-ацетон (1:1). Элюат собирают в концентратор емкостью 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C. Сухой остаток в концентраторе разводят в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм кл пробы.

9.2. Условия хроматографирования

Хроматограф «Кристалл 2000.М» с детектором по захвату электронов (ЭЗД) -14 с пределом детектирования по Линдану 4 х 10 г/куб. см и приспособлениями для капиллярной колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Капиллярная кварцевая колонка HP-5 (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура — 160 °C, нагрев колонки по 6 °C в минуту до 220 °C. Нагрев колонки после анализа по 25 °C в минуту до 260 °C, выдержка 3 мин. Температура испарителя — 230 °C, детектора — 320 °C.

Регулятор расхода гелия — РРГ-11; режим Split less.

Газ 1 — гелий (газ-носитель), расход гелия — 1 куб. см/мин., сброс 1:50, начало сброса — 20 с, длительность сброса — 2 мин.

Газ 2 — гелий, линейная скорость — 28 см/с, давление на входе — 38,21 кПа.

Газ 3 — азот (поддув в детектор), расход во время анализа — 45 куб. см/мин. Расход азота при продувке детектора после анализа — 65 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания каптана — 6 мин. 08 с — 6 мин. 14 с.

Объем вводимой пробы — 1 куб. мм.

Минимально детектируемое количество каптана в анализируемом объеме — 0,01 нг.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,01 — 0,1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией каптана 0,1 мкг/куб. см соответственно, разбавляют.

10. Обработка результатов анализа

Для определения содержания каптана в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:

                           S   x A x V
                            пр

X = ------------- x P, 100 x S x m ст

где: X — содержание каптана в пробе, мг/кг; S — площадь пика стандарта, мВ; ст S — площадь пика образца, мВ; пр

A — концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m — масса анализируемого образца, г;

P — содержание каптана в аналитическом стандарте, %.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

                         2 x |X  - X | x 100
                               1    2
                         ------------------- <= r,                      (1)
                              (X  + X )
                                1    2

где:

    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг;
     1   2

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 сигма . r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

           _

(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,

где: _ X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

                                         X

ДЕЛЬТА = дельта x ---, 100

где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>.

---

<*> 0,01 мг/кг — предел обнаружения.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C должна удовлетворять условию: д

                       C  = ДЕЛЬТА  _ + ДЕЛЬТА  _ ,
                        д         л,X         л,X'

    где   +/- ДЕЛЬТА  _ (+/- ДЕЛЬТА  _ )   -   характеристика   погрешности
                    л,X            л,X'
(абсолютная  погрешность)  результатов анализа,  соответствующая содержанию
компонента в испытуемом образце  (расчетному значению содержания компонента

в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

ДЕЛЬТА = +/- 0,84 ДЕЛЬТА, л

где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

                                          X

ДЕЛЬТА = дельта x ---, 100

где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к

                                  _    _
                             K  = X' - X - C ,
                              к             д

        _    _
    где X',  X,  C  - среднее   арифметическое   результатов   параллельных

              д

определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

                          _____________________

                             /     2            2
                       K = \/ДЕЛЬТА  _  + ДЕЛЬТА  _.
                                   л,X'         л,X

    Проводят сопоставление результата контроля процедуры  (K ) с нормативом

                                                        к

контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

|K | <= K, (2) к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в

условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

                        2 x |X  - X | x 100
                              1    2
                        ------------------- <= R,                       (3)
                             (X  + X )
                               1    2

где:

    X , X  - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
     1   2

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,

табл. 1), %.

14. Разработчики

Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева.

Анализируемый объект	Добавлено каптана, мг/кг	Обнаружено каптана, мг/кг	Доверительный интервал, +/-	Полнота определения, %
Сок винограда	0,01	0,0087	0,0002	86,8
	0,02	0,0172	0,0008	85,8
	0,05	0,0427	0,0025	85,4
	0,1	0,0865	0,0041	86,5

---