МУК 4.1.2405-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств трифенацина (по дифенацину) в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 17.07.2008)
Примечание
Документ введен в действие с 1 сентября 2008 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
17 июля 2008 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТРИФЕНАЦИНА (ПО ДИФЕНАЦИНУ) В ВОДЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2405-08
1 сентября 2008 года
1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.
2. Рекомендованы к утверждению комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 03.07.2008).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 июля 2008 г.
4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде массовой концентрации трифенацина (по дифенацину) в диапазоне 0,0002 — 0,002 мг/куб. дм.
Трифенацин — смесь производных индан-1,3-дионов, основным компонентом которой является дифенацин (дифацинон) — содержание не менее 70%.
2-(дифенилацетил)-индан-1,3-дион (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
Твердое вещество светло-желтого цвета. Температура плавления 145 — 147 °С. Растворимость в органических растворителях (в г/кг): хлороформ — 204; толуол — 73; ксилол — 50; ацетон — 29; этанол — 2,1; н-гептан — 1,8. Практически не растворим в воде — менее 0,3 мг/куб. дм. Растворим в щелочах с образованием солей. Стабилен в течение 14 дней при pH 6 — 9, гидролизуется (< 24 час.) при pH 4. Быстро разлагается в воде на солнечном свету. Слабая кислота, образует водорастворимые соли щелочных металлов.
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD ) в мг/кг: для крыс — 2,3; мышей — 50
340; кроликов - 35; кошек - 14,7; собак - 3 - 7,5; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс - менее 200 мг/кг; острая ингаляционная
50
токсичность (LC ) для крыс — менее 2 мг/куб. дм (4 ч). 50
Дифенацин — ротентицид класса индандионов, обладающий антикоагулянтной активностью, рекомендуется для борьбы с грызунами в открытом грунте (осень, зима, весна) на зимующих культурах (зерновые, пастбищные травы, древесные, кустарниковые насаждения и др.), в защищенном грунте на всех культурах независимо от сезона. Применяется в виде приманки.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (куб. дм) | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, Р = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Вода | От 0,002 до 0,001 вкл. | 100 | 5,2 | 14 | 17 |
| Менее 0,001 до 0,0002 | 150 | 5,4 | 15 | 18 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
| Анализируемый | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | Предел обнаружения, мг/куб. дм | Диапазон определяемых концентраций, мг/куб. дм | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
| Вода | 0,0002 | 0,0002 — 0,002 | 75,5 | 3,6 | 2,0 |
2. Метод измерений
Методика основана на определении трифенацина (по дифенацину) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта на патроне для твердофазной экстракции Sep Pak Silica.
Для расчета содержания трифенацина в пробе воды используют поправочный коэффициент, учитывающий массовую долю дифенацина в трифенацине.
3. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы
3.1. Средства измерений
Жидкостный хроматограф "Perkin Elmer" (США) Номер в Государственном с ультрафиолетовым детектором реестре 15311-02
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см
Пробирки градуированные вместимостью ГОСТ 1770 5 или 10 куб. см
Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770. вместимостью 10, 50, 100 и 1000 куб. см
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2. Реактивы
Дифенацин, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 98,2% («Блок-1»)
Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ 6-09-4326-76
Вода бидистиллированная, деионизованная или ГОСТ 6709 перегнанная над KMnO 4
н-Гексан, хч ТУ 6-09-33-75 Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ
Кислота ортофосфорная, хч, 85% ГОСТ 6552
Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) ГОСТ 4166. эталонный
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3. Вспомогательные устройства, материалы
Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные вместимостью 1000 куб. см ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336
Колбы плоскодонные вместимостью 200 — 250 ГОСТ 9737 куб. см
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью ГОСТ 9737 10, 100 и 250 куб. см
Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм
Патроны для твердофазной экстракции типа Sep-Pak Silica Cartridges (масса сорбента 690 г)
Пробирки центрифужные ГОСТ 25336
Ротационный вакуумный испаритель В-169 ТУ 25-11-917-74 фирмы Buchi, Швейцария
Стаканы химические вместимостью 50 и 100 куб. см ГОСТ 25336
Установка для перегонки растворителей
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 2,0 мм, содержащая Spherisorb(R) S5 ODS 2, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм
Шприц медицинский с разъемом Льюера ГОСТ 22090.
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4. Требования безопасности
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
6. Условия измерений
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для твердофазной экстракции, проверка хроматографического поведения вещества на них, отбор проб.
7.1. Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.2 Очистка этилацетата
Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.
7.1.3 Очистка н-гексана
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.
7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 850 куб. см ацетонитрила, 150 куб. см бидистиллированной или деионизованной воды и 1 куб. см ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
7.3. Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,3 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения
7.4.1 Исходный раствор дифенацина для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,0100 г дифенацина, добавляют 50 — 70 куб. см ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.
Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
7.4.2 Раствор № 1 дифенацина для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора дифенацина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.
Раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено — найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.
7.4.3. Рабочие растворы № 2 — 5 дифенацина для градуировки (концентрация 0,05 — 0,5 мкг/куб. см)
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией дифенацина 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в холодильнике в течение недели.
7.5. Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика дифенацина (относительные единицы) от концентрации вещества в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площади пиков дифенацина.
Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2-х растворов для градуировки различной концентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.
7.6. Приготовление 1% раствора уксусной кислоты в этилацетате
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 50 — 70 куб. см этилацетата, вносят 2 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.
7.7. Подготовка концентрирующего патрона Sep-Pak Silica для очистки экстракта
Патрон Sep-Pak Silica устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 куб. см, используемый в качестве емкости для элюента.
<*> В отсутствии специального аллонжа жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 — 2 капли в сек.
Концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см этилацетата, затем 5 куб. см смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему). Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин., при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.8. Проверка хроматографического поведения дифенацина на концентрирующем патроне Sep-Pak Silica
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора № 1 дифенацина (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещая на 30 сек. в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 куб. см смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему), 20 куб. см смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 куб. см этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 — 2 капли в сек. Элюат отбрасывают.
Дифенацин элюируют с патрона 40 куб. см 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая 5 порций элюата по 5 куб. см каждая непосредственно в круглодонные колбы. Растворы в колбах упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в каждой колбе растворяют в 2-х куб. см подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание дифенацина по п. 9.3. Фракции, содержащие дифенацин, объединяют и вновь анализируют. Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Проверку хроматографического поведения дифенацина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.
8. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °С в течение 10-ти недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °С.
Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.
9. Выполнение определения
9.1. Экстракция
Образец анализируемой воды объемом 500 куб. см помещают в делительную воронку вместимостью 1000 куб. см, добавляют 75 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, фильтруя его через 2-сантиметровый слой безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями этилацетата по 50 куб. см. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.
Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.
9.2. Очистка экстракта
Сухой остаток в колбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 2 куб. см этилацетата, помещая на 30 сек. в ультразвуковую баню. Затем в колбу добавляют 2 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и вносят на концентрирующий патрон Sep-Pak Silica, подготовленный по п. 7.7. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему) и также вносят на патрон. Патрон дополнительно промывают 15 куб. см смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему), 20 куб. см смеси этих же растворителей в объемном соотношении 3:7, затем 20 куб. см этилацетата. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 — 2 капли в сек. Элюат отбрасывают.
Дифенацин элюируют с патрона 35 куб. см 1% уксусной кислоты в этилацетате (п. 7.6), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 2 куб. см подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2) и анализируют содержание дифенацина по п. 9.3.
9.3. Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
Жидкостный хроматограф «Perkin Elmer» (США) с ультрафиолетовым детектором.
Хроматографическая колонка стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 2,0 мм, содержащая Spherisorb(R) S5 ODS 2, зернением 5 мкм.
Температура колонки: комнатная.
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — ортофосфорная кислота (85:15:0,1, по объему).
Скорость потока элюента: 0,3 куб. см/мин.
Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
Ориентировочное время выхода дифенацина: 6,25 — 6,40 мин.
Линейный диапазон детектирования: 1 — 20 нг.
Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор дифенацина с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют (не более чем в 50 раз) подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2).
10. Обработка результатов анализа
Содержание трифенацина в пробе рассчитывают по формуле:
А х W
Х — содержание трифенацина в пробе, мг/куб. дм;
А — концентрация дифенацина, найденная по градуировочному графику, в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;
W — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
V — объем анализируемого образца воды, куб. см;
К — коэффициент пересчета, равный 0,66 <1>.
<1> В случае иного содержания дифенацина в трифенацине коэффициент К соответствует этой величине.
11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/куб. дм;
1 2
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
12. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА) мг/куб. дм при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/куб. дм; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/куб. дм:
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,0002 мг/куб. дм» <*>.
<*> 0,0002 мг/куб. дм — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С >= ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х'
где:
+/- ДЕЛЬТА _, (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности
л,Х л,Х'
(абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию
компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/куб. дм, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/куб. дм:
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/куб. дм.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/куб. дм;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
таблица 1), %.