МУК 4.1.2402-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флутриафола в семенах и масле рапса методом газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 17.07.2008)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 сентября 2008 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
17 июля 2008 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУТРИАФОЛА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2402-08
1 сентября 2008 года
1. Разработаны сотрудниками Всероссийского НИИ защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 июля 2008 г.
4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.
1. Вводная часть
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах и масле рапса массовой концентрации флутриафола в диапазоне концентраций 0,025 — 0,25 мг/кг.
Структурная формула (не приводится)
СА: (+/-)-альфа-(2-фторфенил)-альфа-(4-фторфенил)-1H-1,2,4-триазол-1-этанол
Брутто формула: C H F № O. 16 13 2 3
Химически чистый препарат — твердое белое кристаллическое вещество. -6
Температура плавления: 130 °C. Давление паров при 20 °C 7,1 х 10 mPa. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 2,3 (20 °C).
ow
Растворимость (20 °C): в воде 130 мг/куб. дм, в ацетоне 190 г/куб. дм, дихлорметане 150 г/куб. дм, метаноле 69 г/куб. дм, гексане 0,3 г/куб. дм.
В почве период полураспада DT 65 — 125 дней. 50
Оральная токсичность (LD ) для крыс — 1480 мг/кг. 50
Гигиенические нормативы, МДУ (мг/кг): виноград — н.д., зерно хлебных злаков, свекла сахарная, яблоки, зерно кукурузы, просо, рис, горох, подсолнечник (семена и масло) — 0,05. Для семян и масла рапса гигиенические нормативы не установлены.
Область применения: фунгицид широкого спектра действия для борьбы с болезнями листа и колоса зерновых культур, также применяется для защиты плодовых, зернобобовых и других культур. Используется для борьбы с почвенными, семенными и аэрогенными инфекциями.
2. Методика определения флутриафола в семенах и масле рапса методом газожидкостной хроматографии
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод определения флутриафола в семенах и масле рапса основан на экстракции пестицида органическими растворителями и очистке перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами, а также, при необходимости, на колонке с силикагелем. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора (ТИД).
2.1.2 Избирательность метода
Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.
2.1.3 Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности) +/- дельта, % | Стандартное отклонение повторяемости сигма , % r | Предел повторяемости r, % | Предел воспроизводимости R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена | 0,025 — 0,1 | 50 | 5,4 | 15,1 | 16,6 |
| Семена | 0,1 — 0,25 | 25 | 5,0 | 14,0 | 15,4 |
| Масло | 0,025 — 0,1 | 50 | 5,9 | 16,5 | 18,2 |
| Масло | 0,1 — 0,25 | 25 | 5,7 | 16,0 | 17,6 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего результата +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена | 0,025 | 0,025 — 0,25 | 82,4 | 4,8 | 4,4 |
| Масло | 0,025 | 0,025 — 0,25 | 81,5 | 5,2 | 4,7 |
2.2. Реактивы, материалы
Флутриафол, аналитический стандарт.
Ацетон, ос.ч. 9-5, ТУ 2633-039-4493179-00 или ч.д.а., ГОСТ 2603-79.
Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-76.
н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.
Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.
Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.
Силикагель L 100/400 для хроматографии (0,040 — 0,063 мм) (Хе-мапол, Венгрия).
Хлористый метилен, х.ч., ТУ-2631-020-11291058-96.
2.3. Приборы и посуда
Газовый хроматограф Цвет-550 М или аналогичный с ТИД и стеклянной насадочной колонкой, длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм.
Ванна ультразвуковая УЗВ/100 ТН, ТУ 3.836.008 или аналогичная.
Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001.
Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-2001.
Ротационный испаритель вакуумный Buchi R-205 или аналогичный.
Микрошприц МШ-10, МШ-10М, ТУ 2-833-106.
Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.
Воронки делительные на 500 куб. см, ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.
Цилиндры мерные на 100 куб. см, 500 куб. см, ГОСТ 1774-74.
Колбы мерные на 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.
Стаканы химические, ГОСТ 25336-82Е.
Колонка стеклянная хроматографическая длиной 30 см, диаметром 10 мм.
2.4. Отбор проб
Отбор проб семян и масла рапса и сои - ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
Для длительного хранения семена рапса подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла рапса хранят в холодильнике при 0 — 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °C до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.
2.5.2 Кондиционирование колонки
Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125 — 0,160 мм) с 5% SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °C в течение 8 — 10 часов.
2.5.3 Приготовление стандартного
и градуировочных растворов
Основной раствор флутриафола готовят количественно перенося 10 мг аналитического стандарта флутриафола в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетоне. Из полученного раствора флутриафола с концентрацией 100 мкг/куб. см готовят рабочие растворы с концентрациями 0,5 мкг/куб. см, 1 мкг/куб. см, 2 мкг/куб. см, 4 мкг/куб. см последовательным разведением в ацетоне.
Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют соответствующий раствор аналитического стандарта флутриафола в гексане.
2.5.4 Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика зависимости высоты (площади) пика от концентрации флутриафола в растворе в хроматограф вводят по 2 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты (площади) пиков и строят график зависимости среднего значения высоты, мм (площади, мв/сек.) пика от концентрации флутриафола в градуировочном растворе (мкг/куб. см).
2.5.5 Подготовка колонки с силикагелем
для очистки экстракта
Силикагель прогревают в термостате при 120 °C в течение 3-х часов и охлаждают до комнатной температуры. На дно стеклянной колонки помещают стекловату, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют через воронку суспензией 5 г силикагеля в 25 куб. см гексана при открытом кране колонки, сверху наносят слой 1 см безводного сульфата натрия. Затем колонку промывают 10 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 90:10 и закрывают кран, когда уровень растворителя достигнет верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.
2.5.6 Проверка хроматографического поведения флутриафола
на колонке с силикагелем
В подготовленную колонку пипеткой вносят 1 куб. см стандартного раствора флутриафола в гексане и дают впитаться. После этого в колонку вносят 10 куб. см смеси гексан:ацетон 60:40), элюат отбрасывают. Флутриафол элюируют 40 куб. см смеси гексан:ацетон (15:85), отбирая фракции по 5 куб. см, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Фракции, содержащие флутриафол, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание флутриафола в элюате, определяя его полноту извлечения из колонки и необходимый для этого объем элюента.
Примечание: профиль вымывания флутриафола может изменяться при использовании силикагеля новой партии или другой марки.
2.5.7 Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.
2.6. Проведение определения
2.6.1. Экстракция и очистка экстрактов
2.6.1.1. Семена рапса. Навеску раздавленных в фарфоровой ступке семян (20 г) помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, смачивают 50 куб. см теплой дистиллированной воды и оставляют на 30 мин. для набухания. Затем добавляют 100 куб. см ацетона и экстрагируют флутриафол в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через фильтр «белая лента» на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды. Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку объемом 500 куб. см, добавляют 30 куб. см гексана и встряхивают в течение 2 — 3 мин. После полного разделения фаз нижний водно-ацетоновый слой собирают, при этом эмульсию пограничного слоя разбивают непосредственно перед тем, как предстоит отбор эмульсионного слоя, внесением в него очень малого количества хлористого натрия. Оставшийся в делительной воронке гексановый слой промывают дважды 50 куб. см водного ацетона (50:50), который собирают. Объединенный водно-ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C до объема 150 — 180 куб. см и переносят в делительную воронку. Флутриафол переэкстрагируют в хлористый метилен трижды порциями по 50 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2-х минут. Нижний органический слой собирают, фильтруя через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетона и дальнейшую очистку проводят на колонке с силикагелем (п. 2.6.2).
2.6.1.2. Масло рапса. 20 г масла помещают в делительную воронку объемом 500 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 2:1 и осторожно круговыми движениями перемешивают в течение 2 — 3 минут. Затем добавляют 50 куб. см дистиллированной воды и встряхивают воронку в течение двух минут, происходит разделение слоев и перераспределение флутриафола в водно-ацетоновый слой, который собирают. К гексановому слою в делительной воронке добавляют 50 куб. см водного ацетона (50:50), интенсивно встряхивают и после полного разделения фаз собирают водно-ацетоновый слой. Промывку гексанового слоя повторяют. Собранный водно-ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C до объема 120 — 150 куб. см и переносят в чистую делительную воронку. Флутриафол переэкстрагируют в хлористый метилен трижды порциями по 50 куб. см. Органический слой фильтруют через безводный сульфат натрия и выпаривают досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (90:10) и дальнейшую очистку проводят на колонке с силикагелем (п. 2.6.2).
2.6.2. Очистка экстрактов на колонке с силикагелем
Растворенный в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (90:10) сухой остаток пипеткой количественно переносят в хроматографическую колонку, колбочку ополаскивают еще 1 — 2 куб. см той же смеси и вносят в колонку, после чего открывают кран и дают раствору впитаться в сорбент. Затем в колонку вносят 10 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 60:40, элюат отбрасывают. Флутриафол элюируют 15 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 15:85, элюат собирают и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют.
2.6.3. Условия хроматографирования
Газовый хроматограф Цвет-550 М с ТИД или аналогичный. Колонка стеклянная 1 м х 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 — 0,160 мм) с 5% SE-30.
Температура колонки 220 °C, испарителя 240 °C, детектора 380 °C.
Скорость газоносителя (азот) через колонку 35 куб. см/мин.
Расход водорода 17 куб. см/мин.
Расход воздуха 200 куб. см/мин.
Объем вводимой пробы 2 куб. мм. Время удерживания флутриафола 2,40 мин. +/- 0,05 мин.
2.6.4. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание флутриафола в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
H x C x V
2
где: H — высота (площадь) пика флутриафола в стандартном растворе, мм; 1 H — высота (площадь) пика флутриафола в анализируемой пробе, мм; 2 V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см; P — навеска анализируемого образца, г; C — концентрация флутриафола в стандартном растворе, мкг/куб. см.
Содержание остаточных количеств флутриафола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флутриафола 100 мкг/куб. см, разбавляют.
3. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
4. Оформление результатов
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
где: _ X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,025 мг/кг*, где * — 0,025 мг/кг — предел обнаружения в семенах и масле рапса)».
5. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:
где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = X' - X - C , к д где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
______________________
/ 2 2 K = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
5.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
6. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).
При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.
7. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.
8. Разработчики
Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.