МУК 4.1.2385-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имазалила в семенах подсолнечника, рапса, зерне сои и растительном масле методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 02.07.2008)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 5 сентября 2008 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
2 июля 2008 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМАЗАЛИЛА В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА, РАПСА, ЗЕРНЕ СОИ И РАСТИТЕЛЬНОМ МАСЛЕ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2385-08
5 сентября 2008 года
1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты растений.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 03.04.2008 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 июля 2008 г.
4. Введены в действие с 5 сентября 2008 г.
Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в семенах подсолнечника, сои и рапса массовой концентрации имазалила в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг, в растительном масле — 0,02 — 0,2 мг/кг.
Структурная формула (не приводится).
(+/-)-1-(бета-аллилокси-2,4-дихлорфенилэтил)имидазол (IUPAC).
Брутто формула: C H Cl N O. 14 14 2 2 Химически чистый имазалил представляет собой кристаллическую массу от светло-желтого до коричневого цвета с температурой плавления 52,7 °C,
давлением паров 0,158 мРа (20 °C).
Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K log P = 3,82 (рН ow 9,2 буфер).
Растворимость при 20 °C (г/л): в воде 0,18 (рН 7,6, 20 °C), в гексане 19 г/л, ацетоне, дихлорметане, этаноле, метаноле, изопропаноле, бензоле,
толуоле, ксилоле более 500 г/л, растворим в гептане, петролейном эфире.
Стабилен к гидролизу в разбавленных кислотах и щелочах при комнатной температуре в отсутствие света. Стабилен к свету при нормальных условиях хранения. Стабилен при нагревании до 285 °C. В почве DT 4 - 5 дней, DT 50 90
54 — 68 дней.
Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность для крыс LD 227 - 343 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс
50
LD 4200 — 4880 мг/кг. Класс токсичности по ВОЗ и ЕРА — II. 50
Область применения: системный фунгицид с защитным и лечебным действием.
Гигиенические нормативы для имазалила: МДУ в семенах подсолнечника, сои и рапса 0,02 мг/кг, в масле подсолнечника, сои и рапса 0,04 мг/кг.
газожидкостной хроматографии
1.1 Принцип метода
Методика основана на определении имазалила методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора после его извлечения из образцов органическими растворителями с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами и на колонке с силикагелем.
1.2 Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Объект анализа | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности) +/- дельта, % | Стандартное отклонение повторяемости сигма , % r | Предел повторяемости r, % | Предел воспроизводимости R, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена | 0,01 — 0,1 | 50 | 4,5 | 12,6 | 13,9 |
| Масло | 0,02 — 0,2 | 25 | 5,6 | 15,7 | 17,2 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
ДЛЯ n = 20, P = 0,95
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего результата +/-, % |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 82,6 | 4,9 | 4,5 |
| Масло | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 80,2 | 5,8 | 5,6 |
1.3 Избирательность метода
Избирательность метода определения имазалила достигается условиями подготовки проб и хроматографирования.
2.1 Реактивы и материалы
Аналитический стандарт имазалила с массовой долей основного вещества 97,5%.
Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.
Ацетон, ос.ч., ТУ 2633-004-11291058-94.
Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-76.
н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.
Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-2662-77.
Натрий сернокислый б/в (сульфат), ч.д.а., ГОСТ 4166-76.
Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.
Силикагель 60 (230 — 400 меш) (Мерк, Германия).
Фильтры бумажные, красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.
Фильтры бумажные, белая лента, ТУ 2642-001-42624157-98.
Элюенты для колоночной хроматографии:
элюент № 2 — гексан:ацетон 19:1 (по объему),
элюент № 3 — гексан:ацетон 4:1 (по объему),
2.2 Приборы, аппаратура, посуда
Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с ТИД или аналогичный.
Колонка капиллярная кварцевая длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, с неподвижной фазой НР-35, толщина слоя 0,25 мкм.
Ванна ультразвуковая УЗВ/100 ТН или аналогичная.
Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001.
Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-2001.
Воронки делительные емкостью 10, 250 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82.
Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.
Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.
Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 куб. см, ГОСТ 25336-82.
Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Колонка стеклянная для колоночной хроматографии длиной 27 см, диаметром 7 мм.
Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.
Микрошприц МШ-10, ТУ 2-833-106.
Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.
Ротационный вакуумный испаритель Buchi R-200/205 (Швейцария) или аналогичный.
Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.
Пробирки мерные со шлифом емкостью 10,0 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Стаканы химические на 100, 200 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82.
Цилиндры мерные емкостью 10, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.
2.3 Отбор и хранение проб
Отбор проб семян подсолнечника, сои и рапса для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
Пробы семян просушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре. Перед анализом пробы семян рапса рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают в фарфоровой ступке и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.
Пробы растительного масла хранят в холодильнике при температуре +4 — 6 °C в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.
2.4 Подготовка к определению
2.4.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °C до объема 1 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.
2.4.2 Приготовление градуировочных растворов
Основной раствор готовят растворением в ацетоне (марки ос.ч.) 100 мг аналитического стандарта имазалила в мерной колбе на 100 куб. см. Из полученного раствора с концентрацией 1 мг/куб. см готовят градуировочные растворы с концентрациями 0,2, 0,4, 1,0, 2,0 мкг/куб. см методом последовательного разбавления ацетоном.
Для определения полноты извлечения имазалила из образцов семян используют ацетоновые растворы, для внесения имазалила в образцы растительного масла используют растворы, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления гексаном.
2.4.3 Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация имазалила в растворе) в хроматограф вводят по 2 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имазалила в градуировочном растворе (мкг/куб. см).
2.4.4 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта
Силикагель не менее 5 часов прокаливают при 130 °C, охлаждают и хранят в эксикаторе. Навеску силикагеля 98,5 г помещают в круглодонную колбу и добавляют 1,5 г дистиллированной воды. Колбу плотно закрывают и интенсивно встряхивают в течение 5 минут. Затем колбу присоединяют к ротационному испарителю при атмосферном давлении и медленно вращают 2 часа. Деактивированный таким образом силикагель используют в течение 5 дней.
На дно стеклянной колонки помещают тампон из стекловаты, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют суспензией 2 г силикагеля в 5 куб. см гексана при открытом кране, сверху вносят слой 0,5 см безводного сульфата натрия и промывают колонку 10 куб. см гексана. Когда уровень растворителя достигнет верхнего слоя в колонке, кран закрывают. Колонка готова к работе.
2.4.5 Проверка хроматографического поведения имазалила на колонке с силикагелем
5 мл градуировочного раствора с известной концентрацией имазалила упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.
В колбу с сухим остатком вносят 2 куб. см элюента № 1 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают раствору впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу дважды ополаскивают 2 куб. см элюента № 1 и пипеткой переносят раствор на колонку. Начинают элюирование в градуированную пробирку с притертой пробкой на 10 куб. см. После завершения пробирку закрывают и встряхивают. Таким образом, получена фракция с элюентом № 1.
Ту же колбу, где был сухой остаток, ополаскивают 2 куб. см элюента № 2 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку, колбу ополаскивают 2 куб. см элюента № 2 и переносят на колонку. Таким образом, получена фракция с элюентом № 2.
Эту процедуру повторяют с элюентами 3 и 4 и, таким образом, готовят фракции с элюентами № 3 и № 4.
Элюаты упаривают, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Фракции, содержащие имазалил, объединяют, упаривают, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание имазалила в суммарном элюате, определяя полноту ивлечения из колонки и необходимый для этого объем элюента.
Примечание: профиль вымывания имазалила может изменяться при использовании силикагеля другой партии или марки.
2.4.6 Подготовка приборов и средств измерения
Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.
2.5 Проведение определения
2.5.1 Зерно сои, семена рапса и подсолнечника
Навеску 20 г размолотых до «крупки» на лабораторной мельнице семян подсолнечника, или зерна сои, или раздавленных в фарфоровой ступке семян рапса помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, смачивают 25 куб. см теплой дистиллированной воды и оставляют на 30 минут для набухания. Затем добавляют 50 куб. см ацетона и экстрагируют имазалил в ультразвуковой ванне в течение 15 мин.
Экстракт фильтруют через фильтр «белая лента» на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды.
Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку, добавляют 30 куб. см гексана и встряхивают в течение 2 — 3 мин. После разделения фаз гексановый слой отбрасывают, а водно-ацетоновый возвращают в делительную воронку и промывают еще 2 — 3 раза порциями гексана по 30 куб. см.
Водно-ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе до водного остатка. Раствор количественно переносят в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и встряхивают до растворения соли, затем приливают 50 куб. см дихлорметана, встряхивают 2 мин. и оставляют до полного разделения фаз. Водную фазу отбрасывают, а органическую фазу фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр «красная лента» со слоем безводного сернокислого натрия. Переэкстракцию имазалила из водной среды в органическую повторяют дважды порциями дихлорметана по 30 куб. см. Объединенный фильтрат упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C до сухого остатка.
Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. При наличии мешающих примесей дополнительную очистку проводят на колонке с силикагелем по п. 2.5.3.
2.5.2 Масло сои, рапса, подсолнечника
Навеску масла 10 г растворяют в 50 куб. см гексана в плоскодонной колбе объемом 100 куб. см в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. и оставляют на час. Затем раствор количественно переносят в делительную воронку объемом 250 мл, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и встряхивают воронку в течение 1 — 2 мин. После разделения фаз ацетонитрильный слой собирают. Экстракцию ацетонитрилом повторяют. Объединенный экстракт переносят в чистую делительную воронку на 250 куб. см и ацетонитрильный слой трижды промывают гексаном порциями по 15 — 20 куб. см. Гексановый слой отбрасывают, а промытый ацетонитрильный экстракт упаривают до сухого остатка на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. При наличии мешающих примесей дополнительную очистку проводят на колонке с силикагелем по п. 2.5.3.
2.5.3 Очистка экстрактов на колонке с силикагелем
В колбу с сухим остатком вносят 2 куб. см элюента № 1 и растворяют его в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Пипеткой полностью переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают пробе впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу ополаскивают 2 куб. см элюента № 1, пипеткой переносят раствор на колонку и открывают кран. Элюат отбрасывают.
Продолжают элюирование, как описано в п. 2.4.5 элюентами 2 и 3. Элюаты, содержащие элюенты № 2 и № 3, отбрасывают.
Продолжают элюирование, как описано выше, элюентом № 4. Собранную фракцию упаривают, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание имазалила в пробе.
2.6 Условия хроматографирования
Условия хроматографирования: газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с ТИД, колонка кварцевая капиллярная длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза НР-35, толщина слоя 0,25 мкм. Температура колонки программируется от 100 °C (10 сек.) до 250 °C со скоростью 10 °C/мин. Температура термостата детектора 370 °C, испарителя 240 °C. Расход газа-носителя 1 (азот) — 1,8 куб. см/мин, водорода — 14 куб. см/мин., воздуха — 200 куб. см/мин. Расход газа 2 (азот) в течение 10 с — 0 куб. см/мин., затем 3 куб. см/мин. Расход газа 3 (азот) — 35 куб. см/мин. Дозируемый объем 2 куб. мм. Анализируемый объем 1 куб. см. Время удерживания имазалила 16 мин. 34 с +/- 5 с.
2.7 Обработка результатов анализа
Содержание имазалила в пробе рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:
H x A x V
где: X — массовая концентрация имазалила в пробе, мг/кг; Н — высота (площадь) пика анализируемого вещества, мм (мв x с); Н — высота (площадь) пика аналитического стандарта, мм (мв x с); ст А — концентрация градуировочного раствора имазалила, мкг/куб. см; V — количество экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см; m — масса аналитической пробы, г.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 x |Х - Х | x 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
X , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r - значение предела повторяемости (r = 2,8 сигма ).
r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
где: _ X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг*, где * — 0,01 мг/кг — предел обнаружения).»
5. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:
где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг:
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
К = X' - X - С , к д где X', X, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА . л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.
5.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |X - X | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном
концентраций), %.
6. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).
При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.
7. Требования к квалификации оператора
Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.