МУК 4.1.2277-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Хлороталонила в виноградном и яблочном соках методом газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.09.2007)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 10 декабря 2007 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
24 сентября 2007 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ХЛОРОТАЛОНИЛА В ВИНОГРАДНОМ И ЯБЛОЧНОМ СОКАХ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2277-07
10 декабря 2007 года
1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по защите прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 21 июня 2007 г.).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.
4. Введены в действие с 10 декабря 2007 г.
5. Введены впервые в качестве дополнения.
Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в виноградном и яблочном соках массовой концентрации Хлороталонила в диапазоне 0,005 — 0,1 мг/кг.
Название действующего вещества по ИСО: Хлороталонил.
Название действующего вещества по ИЮПАК: Тетрахлоризофталонитрил.
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C Cl N . 8 4 2
Химически чистый Хлороталонил представляет собой белый кристаллический порошок без запаха.
Давление паров: 0,076 мПа при 25 °C.
Температура плавления: 252,1 °C.
Коэффициент перераспределения н-октанол/вода: K log P = 2,89. ow
Растворимость: ксилол — 80; циклогексан, диметилформамид — 30; ацетон — 20; керосин < 10 г/кг; вода — 0,81 мг/л (при 25 °C).
Хлороталонил является термически и химически стойким соединением, стабилен в кислых и слабощелочных растворах; слабо гидролизуется при
pH > 9. При попадании в почву он сорбируется органическим веществом и слабо
передвигается по профилю. Под влиянием микроорганизмов Хлороталонил относительно быстро разрушается с ДТ - 5 - 36 дней.
50
Краткая токсикологическая характеристика: Хлороталонил относится к малоопасным веществам по острой оральной (ЛД для крыс составляет более
50
10000 мг/кг) и дермальной (ЛД для кроликов составляет более 10000 мг/кг) 50 токсичности и опасным по ингаляционной токсичности (СК 4 час. для крыс 50 0,1 — 0,6 мг/л). При хроническом воздействии может вызывать опухоли почек и желудочно-кишечного тракта.
В России установлены следующие гигиенические нормативы:
ДСД (мг/кг/сут.) массы тела человека — 0,001.
МДУ (мг/кг) в яблоках, винограде — 0,01.
Область применения. Хлороталонил — контактный фунгицид защитного действия, препятствует прорастанию спор и конидий, неспецифично связывая тиольные группы аминокислот, протеинов и пептидов, нарушая функции гликолитических и дыхательных ферментов клеток. Он высоко эффективен против септориоза и ржавчины на яровой и озимой пшенице; против пероноспороза на огурцах открытого грунта, семенниках лука, на хмеле; для борьбы с фитофторозом на картофеле и томатах, а также против различных видов грибковых заболеваний в посевах сахарной свеклы, на плантациях цитрусовых культур, винограда и яблок при нормах расхода 1,0 — 2,5 кг д.в./га.
В России применяется в качестве фунгицида на озимой и яровой пшенице, картофеле, огурцах открытого грунта, семенниках лука, семенных посевах томатов и на плантациях хмеля.
газожидкостной хроматографии
1. Метрологическая характеристика метода
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Виноградный и яблочный соки | 0,01 — 0,1 | 50 | 4,3 | 12 | 14 |
| 0,005 — 0,01 | 100 | 6,2 | 17,5 | 22 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| предел обнаружения, мг/кг | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | среднее значение определения, % | стандартное отклонение, S, % | доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Виноградный и яблочный соки | 0,005 | 0,005 — 0,1 | 86,4 | 2,6 | 1,1 |
Метод основан на определении Хлороталонила методом газожидкостной хроматографии с использованием детектора по захвату электронов (ДПР, ДЭЗ) после его экстракции из соков органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением действующего вещества между несмешивающимися фазами и дополнительной очистки на патроне Диапак С.
Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность метода достигается за счет подбора колонки и условий программирования.
вспомогательные устройства и материалы
3.1 Средства измерений
Весы аналитические СИГМА 11140, фирма «OHAUS».
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г V600, «ACCULAB».
Колбы мерные вместимостью 10, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Микрошприц Гамильтон вместимостью 10 куб. мм.
Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.
Хроматограф газовый «Кристалл 2000м» с детектором по захвату электронов -14 (ЭЗД) с пределом детектирования по Линдану 4 x 10 г/куб. см и приспособлениями для капиллярной колонки.
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 1770.
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Аналитический стандарт Хлороталонила с содержанием д.в. 98,0% (фирма Сингента).
Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.
Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83.
Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.
н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.
Гелий очищенный марки «А», ТУ-51-940-80.
Концентрирующие патроны Диапак С (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94, БиоХимМак.
Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.
Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.
Натрия хлорид, насыщенный водный раствор.
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3 Вспомогательные устройства, материалы
Аппарат для встряхивания проб TYP LT1 фирмы «SKLO UNION».
Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, NALGENE.
Воронки химические для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.
Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней B-480.
Концентраторы грушевидные на 100 и 250 куб. см, НШ 29 КГУ-100 (250), ГОСТ 10394-72.
Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма J&W Scientific.
Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.
Фильтры бумажные «красная лента», ТУ 6-09-2678-77.
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками — по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.
К подготовке проб допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
7.1 Подготовка патронов для очистки экстрактов
7.1.1 Подготовка концентрирующего патрона С (Диапак)
Все растворы пропускают через патрон под вакуумом, скорость потока растворов не более 2 мл/мин. (или 1 капля в 2 секунды). Патрон устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл, который используют как емкость для элюентов.
Патрон кондиционируют, пропуская через него последовательно 10 мл ацетона и 10 мл гексана. Смывы отбрасывают.
Нельзя допускать осушения поверхности патрона!
7.1.2 Проверка хроматографического поведения
Хлороталонила на патроне Диапак С
В концентратор объемом 100 мл помещают 1 мл стандартного раствора Хлороталонила в ацетоне с концентрацией 0,1 мкг/мл. Ацетон выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Хлороталонил в концентраторе растворяют в 5 мл гексана, тщательно обмывают концентратор, наносят раствор на патрон и пропускают через него со скоростью, указанной в разделе 7.1.1. Смыв отбрасывают.
Промывают патрон 10 мл гексана, смыв отбрасывают. После этого последовательно пропускают через патрон 3 порции смеси гексан:ацетон (10:1) по 5 мл каждая, собирая каждую порцию в отдельный концентратор. Собранные фракции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мкл пробы. Фракции, содержащие Хлороталонил, объединяют, выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток вновь растворяют в 1 мл ацетона и вводят в хроматограф 1 мкл пробы. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва с колонки и необходимый для очистки объем элюата.
7.2 Подготовка и кондиционирование колонки
для газожидкостной хроматографии
Капиллярную колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе гелия при температуре на 20 °C ниже предельного значения для выбранной неподвижной фазы в течение 8 — 10 часов.
7.3 Приготовление рабочих растворов
7.3.1 Приготовление насыщенного водного раствора
хлористого натрия
В коническую колбу объемом 250 куб. см наливают 150 мл дистиллированной воды и насыпают в нее хлористый натрий при постоянном помешивании до тех пор, пока не образуется стойкий осадок. Колбу выдерживают в течение 30 мин., периодически помешивая раствор. Если осадок растворился, добавляют еще хлористого натрия до образования стойкого осадка.
7.3.2 Приготовление стандартных растворов
Навеску 50 мг Хлороталонила (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор № 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток. Методом последовательного разбавления готовят стандартный раствор в ацетоне № 2 с концентрацией 0,5 мкг/мл, который можно хранить в холодильнике в течение 30 дней.
Методом последовательного разбавления ацетоном исходного раствора № 2 готовят рабочие растворы Хлороталонила с концентрацией 0,005; 0,01; 0,05; 0,1 мкг/куб. см для построения калибровочного графика и для внесения в образцы, которые могут храниться в холодильнике не более 30 суток.
7.4 Построение градуировочного графика
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Хлороталонила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,005; 0,01; 0,05; 0,1 мкг/куб. см.
В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования (п. 9.2). Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Хлороталонила в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 — не приводится).
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» № 2051-79 от 21.08.79, а также с ГОСТ 25892-83 — «Сок виноградный натуральный, ТУ» и ГОСТ 656-79 «Соки плодовые и ягодные натуральные. ТУ».
Пробы соков хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре +4 °C не более 10 суток.
9.1 Виноградный и яблочный соки
9.1.1 Экстракция Хлороталонила из анализируемой пробы
Пробу сока 10 г помещают в полипропиленовую банку с крышкой на 250 куб. см, добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, 2 г кристаллического хлористого натрия и приливают 30 куб. см ацетонитрила. Банку с содержимым встряхивают на встряхивателе в течение 15 мин. После встряхивания все содержимое банки переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. После разделения фаз нижний слой сливают в стакан емкостью 100 куб. см, а ацетонитрил — в чистую колбу емкостью 250 куб. см.
Водно-солевую фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют переэкстракцию Хлороталонила в ацетонитрил еще 2 раза, используя каждый раз по 20 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь в течение двух минут. Водную фракцию отбрасывают. Объединенный ацетонитрильный экстракт переносят в делительную воронку, оставляют стоять 15 мин. Отделившийся водный слой отбрасывают.
Экстракт в воронке промывают двумя порциями гексана по 15 куб. см каждая, гексан отбрасывают. Оставшийся ацетонитрильный экстракт переносят в концентратор и выпаривают его на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка при температуре 40 °C.
К водному остатку в концентраторе прибавляют 25 куб. см воды, перемешивают содержимое концентратора и переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. Обмывают концентратор еще двумя порциями воды по 25 куб. см каждая и сливают в ту же делительную воронку. Приливают в делительную воронку 40 куб. см гексана и встряхивают содержимое воронки в течение 1 — 2 минут. После расслоения фаз нижний водный слой сливают в стакан объемом 150 куб. см, а гексан — через воронку с безводным сульфатом натрия в концентратор емкостью 250 куб. см. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 40 куб. см гексана. Объединенный гексановый экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C.
Далее проводят очистку пробы на колонке с Флоризилом.
9.1.2 Очистка экстракта на патроне Диапак С
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 куб. см гексана, отбирают пипеткой аликвоту объемом 5 куб. см и наносят на патрон, подготовленный как указано в п. 7.1.1.
Промывают патрон 10 куб. см гексана, смыв отбрасывают. Пропускают через патрон 15 куб. см, собирают смыв в концентратор и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм пробы.
9.2 Условия хроматографирования
Хроматограф газовый «Кристалл 2000м» с детектором по захвату электронов -14 (ЭЗД) с пределом детектирования по Линдану 4 x 10 г/куб. см и приспособлениями для капиллярной колонки.
Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма J&W Scientific.
Температура термостата колонки программированная: начальная температура — 120 °C, выдержка — 4 минуты, нагрев колонки по 10 °C в минуту до 170 °C, затем по 25 °C в минуту до 210 °C; время анализа — 11 мин.
Температура испарителя — 250 °C, детектора — 340 °C.
Газ 1 — гелий (газ-носитель), давление на входе — 6 кПа, линейная скорость — 22,984 см/сек., давление на выходе — 101,3 кПа; поток через колонку — 2,504 куб. см/мин.; мертвое время — 0,73 мин.
Газ 2 — гелий, режим — Splitless, деление потока — 1:40 (сброс пробы), начало сброса — 30 секунд, длительность сброса — 2 минуты, расход во время анализа — 10 куб. см/мин.
Регулятор давления гелия — РРГ-10.
Регулятор расхода гелия — РРГ-11.
Газ 3 — азот (поддув в детектор), расход во время анализа — 45 куб. см/мин.
Продувка детектора и испарителя азотом после анализа — по 50 куб. см/мин. в течение 3 минут при температуре колонки 250 °C. Расход газов: Г1 — 50; Г2 — 40; Г4 — 40 куб. см/мин.
Абсолютное время удерживания Хлороталонила — 10 мин. 5 сек.
Минимально детектируемое количество Хлороталонила в анализируемом объеме — 0,005 нг.
Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,005 — 0,1 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Хлороталонила 0,1 мкг/см, соответственно разбавляют.
10. Обработка результатов анализа
Для определения содержания Хлороталонила в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:
S x A x V
пр
X = ------------- x P, 100 x S x m ст
где: X — содержание Хлороталонила в пробе, мг/кг; S — площадь пика стандарта, мВ; ст S — площадь пика образца, мВ; пр A — концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см; V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см; D — коэффициент пересчета на аликвоту, равный 2-м; m — масса анализируемого образца, г; P — содержание Хлороталонила в аналитическом стандарте, %.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1): 2 x |X - X | x 100 1 2 ------------------- <= r, (1) (X + X ) 1 2
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
_ _
(X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности P = 0,95,
где: _ Х — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг» <*>.
<*> — 0,05 мг/кг — предел обнаружения.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,X л,X' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,X л,X' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к
_ _ K = X' - X - C , к д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 K = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,X' л,X Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом
к
контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».