МУК 4.1.2269-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в зеленом луке и луке-репке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.09.2007)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 10 декабря 2007 года.
Утверждаю
Руководитель
Федеральной службы
по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
24 сентября 2007 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АЗОКСИСТРОБИНА (ICIA 5504) И ЕГО ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО ИЗОМЕРА (R 230310) В ЗЕЛЕНОМ ЛУКЕ И ЛУКЕ-РЕПКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2269-07
10 декабря 2007 года
1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (В.А. Калинин — профессор, канд. с-х. наук, Е.В. Довгилевич — ст. н. сотр., канд. биол. наук, А.В. Довгилевич — ст. н. сотр., канд. хим. наук, Н.В. Устименко — ст. н. сотр., канд. биол. наук).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 21.06.2007).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.
4. Вводятся в действие с 10 декабря 2007 г.
Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг в зеленом луке и луке-репке.
Название вещества по ИСО: Азоксистробин.
Название вещества по ИЮПАК: метил(Е)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.
Структурная формула: (не приводится)
Эмпирическая формула: C H № O . 22 17 33 5
Агрегатное состояние: порошок.
Цвет, запах: белого цвета, без запаха.
Коэффициент распределения н-октанол — вода: Kow logP = 2,5 (20 °C).
Растворимость в воде (25 °C): 6,2 (pH 5,2), 6,7 (pH 7,0), 5,9 (pH 9,2) мг/куб. дм.
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм при 20 °C): ацетон — 86, ацетонитрил — 340, гексан — 0,057, дихлорметан — 400, метанол — 20, толуол — 55, этилацетат — 130, н-октанол — 1,40.
Азоксистробин стабилен в водных растворах при pH 3 — 10 при комнатной температуре. Период полураспада в почве в полевых условиях от 3-х до 39 дней. Основным путем превращения вещества на поверхности растений и почвы является фотолитическая изомеризация с образованием геометрического Z-изомера.
Краткая гигиеническая характеристика: Азоксистробин относится к малоопасным веществам по острой оральной (ЛД для крыс свыше 5000 мг/кг) и
50
дермальной (ЛД свыше 2000 мг/кг) токсичности и умеренно опасным по 50 ингаляционной токсичности (ЛК для крыс — 698 — 962 мг/куб. м). Не 50 обладает побочными токсикологическими эффектами, может вызвать слабое раздражение при попадании на кожу и слизистую оболочку глаз.
В России установлены следующие гигиенические нормативы:
МДУ (мг/кг) в винограде, огурцах и томатах — 0,2.
Область применения: Азоксистробин — фунгицид из группы стробилуринов системного и контактного действия с длительным защитным эффектом. Высокоэффективен против возбудителей ложной и настоящей мучнистой росы, в том числе против рас возбудителя, устойчивых к Металаксилу и производным триазола. Применяется в России в качестве фунгицида на плантациях лука-репки, томатах и огурцах открытого и защищенного грунта с нормой расхода 0,1 — 0,15 кг д.в./га, на зерновых культурах — 0,125 — 0,250 кг д.в./га, а также на виноградниках — 0,15 — 0,20 кг д.в./га при 2-кратной обработке.
R 230310 — Z-геометрический изомер Азоксистробина.
Название действующего вещества по ИСО: метил(Z)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)-пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.
Структурная формула: (не приводится)
R 230310 представляет собой кристаллический порошок желтого цвета.
Физико-химические свойства близки к таковым Азоксистробина.
Главный метаболит в процессе фотолиза основного вещества. Данные по токсикологии вещества фирмой не представлены.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, % P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Зеленый лук | 0,01 — 0,1 | 50 | 5 | 14,0 | 16,7 |
| 0,1 — 0,5 | 25 | 4 | 11,2 | 13,3 | |
| Лук-репка | 0,01 — 0,1 | 50 | 4 | 11,2 | 13,3 |
| 0,1 — 0,5 | 25 | 3 | 8,4 | 10,0 |
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, % P = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Зеленый лук | 0,01 — 0,1 | 50 | 4 | 11,2 | 13,3 |
| 0,1 — 0,5 | 25 | 3 | 8,4 | 10,0 | |
| Лук-репка | 0,01 — 0,1 | 50 | 4 | 11,2 | 13,3 |
| 0,1 — 0,5 | 25 | 3 | 8,4 | 10,0 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблицах 3 и 4.
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
ДЛЯ АЗОКСИСТРОБИНА (ICIA 5504)
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| предел обнаружения, мг/кг | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | среднее значение определения, % | стандартное отклонение, S, % | доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| Зеленый лук | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 82,1 | 3,1 | 1,5 |
| Лук-репка | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 81,9 | 2,4 | 1,2 |
ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ
ОТКЛОНЕНИЕ, ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
ДЛЯ ГЕОМЕТРИЧЕСКОГО ИЗОМЕРА АЗОКСИСТРОБИНА (R 230310)
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20 | ||||
| предел обнаружения, мг/кг | диапазон определяемых концентраций, мг/кг | среднее значение определения, % | стандартное отклонение, S, % | доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| Зеленый лук | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 81,9 | 3,3 | 1,4 |
| Лук-репка | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 77,4 | 3,2 | 1,4 |
Методика основана на одновременном определении Азоксистробина и его геометрического изомера (R 230310) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после их экстракции из образцов смесью органического растворителя с водой, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак Амин и Диапак C8).
Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности. Условия хроматографирования позволяют с высокой достоверностью детектировать и идентифицировать Азоксистробин и его изомер при совместном присутствии.
3.1 Средства измерений
Весы аналитические «OHAUS», СИГМА 11140.
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г «ACCULAB» V600.
Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50 — 100 куб. мм фирмы Гамильтон.
Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.
Хроматограф жидкостной Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа, номер госрегистрации 15311-02.
Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Азоксистробин ICIA 5504, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,7%, фирма Зенека.
R 230310, аналитический стандарт с содержанием д.в. 96,0%, фирма Зенека.
Ацетон, ос.ч., ТУ 2633-00-4-11291058-94.
Ацетонитрил, ос.ч., УФ-205 нм, ТУ 6-09-2167-84.
Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 7602-72.
Гексан, х.ч. для спектроскопии, ТУ 6-09-06-657-84.
Калий марганцовокислый, ч.д.а., ГОСТ 20490-75.
Кальций хлористый, х.ч., ГОСТ 4161-76.
Натрий сернокислый, безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.
Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77.
Концентрирующие патроны Диапак Амин (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.
Концентрирующие патроны Диапак C8 (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.
Этиловый эфир уксусной кислоты, ГОСТ 22300-76.
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.3 Вспомогательные устройства и материалы
Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак Амин и Диапак C8.
Аппарат для встряхивания проб «SKLO UNION TYP LT1».
Банки с крышками для экстракции на 250 мл, полипропилен, кат. № 3120-0250, NALGENE.
Ванна ультразвуковая «UNITRA» UNIMA OLSZTYN UM-4.
Воронки химические для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.
Воронки делительные на 250 мл, ГОСТ 10054-75.
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi или ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 с водяной баней.
Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 мл, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.
Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP 8, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.
Колбы конические плоскодонные объемом 250, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 9737-70.
Концентраторы грушевидные и круглодонные, объемом 100 и 250 куб. см, ГОСТ 10394-75.
Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.
Предколонка хроматографическая стальная, Symmetry C 18, длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.
Стаканы стеклянные объемом 100 — 500 куб. см, ГОСТ 25366-80Е.
Установка для перегонки растворителей, ГОСТ 9737-70.
Фильтры бумажные, «красная лента», ТУ-6-09-1678-86.
Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с размером пор 20 мкм, фирма Уотерс.
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин и Диапак C8 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.
7.1 Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетона
Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 438 — 439).
7.1.2 Очистка ацетонитрила
7.1.3 Очистка гексана
Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 441).
7.1.4 Очистка бидистиллированной воды
Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/куб. дм, и затем перегоняют.
7.1.5 Очистка этилового эфира уксусной кислоты
Этиловый эфир уксусной кислоты промывают равным объемом 5% раствора соды, сушат над безводным хлористым кальцием (Беккер Г. и др. Органикум, Москва, 1979 г., с. 372), кипятят в течение 1 часа с прокаленным сульфатом магния и затем перегоняют.
7.2 Приготовление растворов для проведения анализа
7.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.
В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 500 куб. см ацетонитрила и 500 куб. см очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
7.2.2 Приготовление градуировочных растворов
7.2.2.1 Стандартный раствор с концентрацией
Азоксистробина (ICIA 5504) 1,0 мг/куб. см
Взвешивают 50 мг Азоксистробина в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор № 1, концентрация Азоксистробина — 1 мг/куб. см). Стандартный раствор № 1 можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.
7.2.2.2 Стандартный раствор с концентрацией
геометрического изомера (R 230310) 1,0 мг/куб. см
Взвешивают 50 мг геометрического изомера Азоксистробина R 230310 в мерной колбе объемом 50 куб. см, растворяют в ацетонитриле, доводят до метки ацетонитрилом (стандартный раствор № 2, концентрация геометрического изомера Азоксистробина R 230310 — 1 мг/куб. см). Стандартный раствор № 2 можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.
7.2.2.3 Стандартный раствор с концентрацией
Азоксистробина (ICIA 5504) и геометрического изомера
(R 230310) 10,0 мкг/куб. см (каждого)
В мерную колбу объемом 100 куб. см помещают по 1 куб. см стандартных растворов № 1 и 2, доводят до метки ацетонитрилом, в результате чего получают объединенный стандартный раствор № 3 с концентрацией Азоксистробина и геометрического изомера Азоксистробина R 230310 — 10 мкг/куб. см (каждого).
7.2.2.4 Стандартные растворы Азоксистробина
(ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310)
с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см
для построения калибровочной кривой
и внесения в растительные образцы
Из объединенного стандартного раствора № 3 методом последовательного разведения готовят объединенные стандартные растворы Азоксистробина и геометрического изомера Азоксистробина R 230310 в ацетонитриле с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 мкг/куб. см и используют эти растворы для хроматографического исследования, построения калибровочной кривой и внесения в контрольные образцы.
7.3 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Азоксистробина и его геометрического изомера (R 230310) в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см каждого вещества (п. 7.2.2.4).
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят графики зависимости площади пика от концентрации Азоксистробина и его геометрического изомера (R 230310). Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений (рисунок 1 и 2 — не приводятся).
7.4 Подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин
и Диапак C8 для очистки экстрактов
7.4.1 Подготовка концентрирующего патрона Диапак Амин
для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.
Патрон Диапак Амин устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 куб. см смеси гексан — этилацетат в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
7.4.1.1 Проверка хроматографического поведения
Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического
изомера (R 230310) на концентрирующем
патроне Диапак Амин
Из стандартного раствора Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см (по п. 7.2.2.4), отбирают 1 куб. см, переносят в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси гексан — этилацетат в соотношении 9:1, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну, тщательно обмывая стенки концентратора, и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
Исходный концентратор обмывают последовательно тремя порциями по 5 куб. см смеси гексан — этилацетат 1:3 и смесь вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции собирают в отдельные концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), объединяют их и рассчитывают объем растворителя, необходимого для вымывания веществ из патрона.
7.4.1.2 Очистка экстракта на концентрирующих
патронах Диапак Амин
Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси гексан — этилацетат в соотношении 9:1, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну, тщательно обмывая стенки концентратора, и полученный раствор вносят на патрон.
7.4.2 Подготовка концентрирующего патрона Диапак C8
для очистки экстракта
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. При работе на патронах Диапак C8 используют очищенную воду.
Патрон Диапак C8 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:1 и 10 куб. см воды. Элюат отбрасывают.
Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!
7.4.2.1 Проверка хроматографического поведения
Азоксистробина (IC1A 5504) и его геометрического
изомера (R 230310) на концентрирующем патроне Диапак C8
Из стандартного раствора Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см (по п. 7.2.2.4), отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и добавляют туда 9 куб. см воды. Смесь перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:5 и смесь вносят на патрон. Элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор еще раз обмывают последовательно тремя порциями по 5 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:1 и каждую порцию отдельно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), объединяют их и рассчитывают объем растворителя, необходимого для вымывания вещества из патрона.
7.5 Подготовка и кондиционирование колонки
для жидкостной хроматографии
Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP8 с предколонкой Symmetry C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 — 4 часа.
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также с ГОСТ 27166-86 «Лук репчатый свежий реализуемый. ТУ» и ГОСТ 1723-86 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговле. ТУ».
Зеленый лук и не созревшие луковицы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C до 2-х лет. Пробы созревшего лука-репки подсушивают и хранят при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света не более 6 месяцев. Для длительного хранения созревшие луковицы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C до 2-х лет.
9.1 Зеленый лук и лук-репка
9.1.1 Экстракция
Образец измельченной пробы лука массой 10 г переносят в коническую колбу объемом 250 куб. см, приливают 50 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 7:3 и помещают на 10 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 10 минут на механический встряхиватель. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлорида натрия. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, используя по 50 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 7:3. Экстракты объединяют в конической колбе с хлоридом натрия, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 минут. Затем содержимое колбы (без нерастворившейся соли) переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см и выдерживают 5 минут. Выделившуюся нижнюю водную фазу сливают в стакан и отбрасывают, а верхнюю ацетонитрильную возвращают в делительную воронку.
9.1.2 Очистка экстракта перераспределением в системе
несмешивающихся растворителей
К ацетонитрильному экстракту в делительной вороне прибавляют 50 куб. см гексана и встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения слоев в делительной воронке выделившуюся воду (нижний слой объемом ~ 2 куб. см) сливают в стакан и отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C. Верхний гексановый слой также отбрасывают.
К сухому остатку в концентраторе прибавляют 3 куб. см этилацетата и обмывают стенки концентратора. Туда же прибавляют 50 куб. см гексана и переносят содержимое колбы в сухую делительную воронку объемом 250 куб. см. Приливают в делительную воронку 20 куб. см ацетонитрила и встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в коническую колбу объемом 250 куб. см. Повторяют операцию еще 2 раза, используя каждый раз по 20 куб. см ацетонитрила и объединяя экстракт в колбе. Гексановую фракцию отбрасывают.
Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку, прибавляют туда 50 куб. см гексана и встряхивают 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C. Гексан отбрасывают.
9.1.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах
Диапак C8 и Диапак Амин
Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2 растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 9 куб. см воды, тщательно обмывая стенки концентратора. Полученный раствор вносят на патрон Диапак C8. Элюат отбрасывают. (В том случае, если пробы интенсивно окрашены, используют 2 соединенных последовательно патрона Диапак C8).
Концентратор обмывают двумя порциями по 5 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:5 и смесь вносят на патрон. Элюат отбрасывают.
Тот же концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода в соотношении 1:1 и раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см гексан — этилацетат в соотношении 9:1 и наносят на патрон Диапак Амин. Элюат отбрасывают.
Концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексан — этилацетат 1:3 и смесь вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.
9.2 Условия хроматографирования
Хроматограф «Waters» или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.
Колонка стальная Symmetry Shield RP8, 4,6 мм x 25 см, зернением 5 мкм.
Предколонка стальная Symmetry С18, 3,9 мм x 2 см, зернением 5 мкм.
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода в соотношении 50:50.
Время удерживания Азоксистробина (ICIA 5504) — 12,98 — 13,65 мин.; его геометрического изомера (R 230310) 10,27 — 10,69 мин.
Чувствительность 0,003 ед. оптической плотности на шкалу.
Объем вводимой пробы 20 куб. мм.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.
Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Millenium 3.05.01.
Альтернативная обработка результатов:
Содержание Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) рассчитывают по формуле:
S x A x V
пр
X = ------------- x P, 100 x S x m ст
где: X — содержание Азоксистробина (ICIA 5504) или его геометрического изомера (R 230310) в пробе, мг/кг или мг/куб. дм; S — высота (площадь) пика стандарта, мм; ст S — высота (площадь) пика образца, мм; пр A — концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см; V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см; m — масса анализируемого образца, г; P — содержание Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в аналитическом стандарте, %.
ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(X + X )
1 2
X , X - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
_
(X +/- ДЕЛЬТА) мг/кг при вероятности P = 0,95,
где: _ X — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг» <*>.
<*> — 0,01 мг/кг — предел обнаружения.
13. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки C должна удовлетворять условию: д
C = ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , д _ _ л,X л,X'
+/- ДЕЛЬТА (+/- ДЕЛЬТА ) - характеристика погрешности (абсолютная
_ _
л,X л,X'
погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в
испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с
добавкой соответственно) мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг; _
где дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к
_ _ K = X' - X - C , к д _ _ где X', X, C - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.
Норматив контроля K рассчитывают по формуле:
_______________________
/ 2 2
K = \/ ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА .
_ _
л,X' л,X
Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом
к
контроля (K).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)
2 x |X - X | x 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(X + X )
1 2
X , X - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Калинин В.А., профессор, канд. с-х. наук, Довгилевич Е.В., ст. н. сотр., канд. биол. наук, Довгилевич А.В., ст. н. сотр., канд. хим. наук, Устименко Н.В., ст. н. сотр., канд. биол. наук.
Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультативный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов». 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон (095)976-37-68, факс: (095)976-43-26.