МУК 4.1.2229-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение домоевой кислоты в морепродуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 17.07.2007)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОМОЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОРЕПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Методические указания разработаны ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, С.А. Хотимченко, Ю.А. Коханова, Т.В. Киселева, К.И. Эллер).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Роспотребнадзора (протокол № 2 от 21 июня 2007 г.).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 июля 2007 г.

4. Введены в действие 1 ноября 2007 г.

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают метод определения домоевой кислоты в морепродуктах на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.

2. Общие положения

2.1. Представителем группы фикотоксинов является домоевая кислота (амнестический яд моллюсков). Основным продуцентом токсина являются диатомовые микроводоросли рода Pseudo-nitzschia. В зависимости от количества токсина, поступившего в организм, клиническая картина отравления может варьировать от гастроинтестинальных симптомов (тошнота, рвота, диарея, боли в животе) и неврологической симптоматики (сильные головные боли, головокружение и т.д.) до перманентной потери краткосрочной памяти и летального исхода. Воздействуя на глютаматные рецепторы нервной системы, токсин вызывает нейрональную дегенерацию, а морфологические изменения тканей характеризуются некрозом глубинных структур мозга (гиппокамп, миндалевидное ядро, таламус).

2.2. В настоящее время во многих странах норматив содержания токсина в двустворчатых моллюсках определен на уровне не более 20 мкг/г ткани моллюска. Содержание домоевой кислоты в крабах нормируется только для внутренних органов (не более 30 мг/кг). Известно, что распространение домоевой кислоты по пищевой цепи затрагивает и другие морские организмы, в том числе ракообразных, головоногих моллюсков, рыб и даже млекопитающих (киты, морские львы, тюлени). Таким образом, источником поступления токсина в организм человека является потребление морепродуктов.

2.3. В связи с тем, что при попадании в организм небольшого количества токсина отмечаются только неспецифические гастроинтестинальные симптомы, возможна гиподиагностика данного отравления. Это определяет необходимость разработки доступных и надежных методов обнаружения и количественного определения домоевой кислоты, что позволит проводить надзор за содержанием этого вещества в морепродуктах и оценить риск его влияния на здоровье населения.

Структурная формула: (не приводится).

    Эмпирическая формула: C  H  NO .
                           15 21  6

Молекулярная масса: 311,14.

Количественный метод определения домоевой кислоты в морепродуктах при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии отличается низким пределом обнаружения (0,5 мкг/г), хорошей воспроизводимостью и надежностью (табл. 1 в разделе 11). Диапазон определяемых концентраций составляет 0,5 — 200 мкг/г. Относительная погрешность измерений составляет 25%.

3. Отбор и подготовка проб

Отбор морепродуктов осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 7631 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний».

Отобранные образцы морепродуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки либо стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, замораживают и хранят при температуре не менее -10 °С, используя для этой цели морозильники или соответствующие приспособления.

После извлечения тела моллюска из раковины его необходимо обсушить для удаления соленой воды. Измельчить образцы в приборе для грубого измельчения. Подготовка образцов из этого гомогената может быть произведена либо немедленно после измельчения, либо позднее после повторного перемешивания. Гомогенат может храниться не более месяца при температуре -10...-20 °С, в плотно закрытой емкости.

4. Принцип метода

Метод основан на экстракции домоевой кислоты из гомогенизированных тканей морепродуктов водным раствором метанола (1:1, v/v). Количество токсина определяется при помощи ВЭЖХ с УФ-детектором в обращенно-фазном варианте.

5. Аппаратура, материалы, реактивы

Жидкостный хроматограф с УФ-детектором (любой марки), длина волны 242 нм.

Колонка с обращенной фазой (С18) (Vydac 201TP, Supelco LC-PAH) или эквивалентная, длина 25 см, диаметр 4,6 мм, диаметр сорбента 5 мкм.

Прибор для грубого измельчения тканей (блендер).

Гомогенизатор лабораторный.

Центрифуга любого типа, обеспечивающая 4000 об./мин.

рН-метр.

Весы аналитические по ГОСТ 24104.

Цилиндры мерные объемом 100, 200, 500 куб. см по ГОСТ 1770.

Колбы мерные на 25 куб. см по ГОСТ 1770.

Колбы мерные на 500 куб. см по ГОСТ 1770.

Колбы конические на шлифе 500 куб. см ГОСТ 25336.

Пипетки 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см по ГОСТ 29227.

Одноканальные автоматические пипетки переменного объема 100 — 1000 куб. мм.

Одноканальные автоматические пипетки переменного объема 1,0 — 5,0 куб. см.

Пробирки центрифужные 10 куб. см по ГОСТ 1770.

Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.

Фильтры метанол-совместимые с диаметром пор 0,45 мкм (Macherey-Nagel) либо аналогичные.

Система для твердофазной экстракции (Macherey-Nagel, Supelco) либо аналогичная.

Патроны для твердофазной экстракции вместимостью 3 куб. см, содержащие 500 мг силикагеля с закрепленными четвертичными аммониевыми группами (JT Baker Scientific, Supelco), либо аналогичные.

Виалы темные с винтовой крышкой объемом 2 куб. см (Supelco) либо аналогичные.

Стекла часовые по ГОСТ 14183.

Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Метанол (спирт метиловый) по ГОСТ 6995.

Трифторуксусная кислота (спектрофотометрического качества), хч.

Лимонная кислота (моногидрат), хч, по ГОСТ 3652.

Натрий лимоннокислый трехзамещенный 2-водный, хч.

Аммиак водный, хч, по ГОСТ 3760.

Домоевая кислота-стандарт, импорт.

6. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором проводится определение домоевой кислоты, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

7. Подготовка к испытанию

7.1 Приготовление реактивов

7.1.1 Приготовление мобильной фазы для ВЭЖХ

Подкислить воду трифторуксусной кислотой до значения рН 2,5.

Градиентная мобильная фаза для ВЭЖХ:

Время (мин.)	Соотношение компонентов мобильной фазы
	вода	ацетонитрил	метиловый спирт
0,0	89	10	1
15,0	85	14	1
20,0	89	10	1
25,0	89	10	1

7.1.2 Приготовление калибровочных растворов

Стандарт домоевой кислоты (5 мг) аккуратно растворить в мерной колбе на 25 куб. см в растворе (ацетонитрил:вода — 1:9) и довести до метки для получения стандартного раствора 200 мкг/куб. см (стандартный раствор 1).

Пипеткой отобрать 2 куб. см стандартного раствора 1, внести его в мерную колбу и довести до 25 куб. см раствором (ацетонитрил:вода — 1:9) для получения стандартного раствора 16 мкг/куб. см.

Повторить эту процедуру еще два раза для получения стандартных растворов с концентрацией 1,28 и 0,1024 мкг/куб. см. Калибровочная кривая представлена на рис. 1 (не приводится) (раздел 10).

Хранить не более 1 года при температуре -12 °С в темноте. Заморозить неиспользованные растворы. При повторном использовании довести до комнатной температуры.

7.1.3 Приготовление рабочих растворов

• раствор для экстракции: смешать равные количества перегнанного метанола и воды (из расчета 6 куб. см метанола и 6 куб. см воды на 1 образец (3,0 г ткани));
• раствор для патронов твердофазной экстракции и промывания петли: смешать ацетонитрил и воду (ацетонитрил:вода — 1:9),
• цитратный буфер (0,5 М, рН 3,2): растворить 52,55 г моногидрата лимонной кислоты в 400 куб. см дистиллированной воды. Довести рН раствора до значения 3,2 концентрированным раствором аммиака водного.

Добавить 50 куб. см ацетонитрила и довести до 500 куб. см дистиллированной водой.

Также этот буфер может быть приготовлен следующим образом: растворить 40,4 г моногидрата лимонной кислоты и натрий лимоннокислый трехзамещенный 2-водный (17,0 г) в 400 куб. см дистиллированной воды, добавить 50 куб. см ацетонитрила и довести до 500 куб. см дистиллированной водой.

8. Проведение испытания методом ВЭЖХ

8.1 Подготовка образца для определения домоевой кислоты

Экстракция: взвешивают 3,0 г измельченной ткани моллюсков. Добавляют 12,0 куб. см экстракционного растворителя (метанол:вода — 1:1) и гомогенизируют 3 мин. при 2000 rpm. Обязательна тщательная промывка гомогенизатора для предупреждения смешивания образцов. Центрифугируют при 4000 об./мин. в течение 10 мин. Отфильтровывают 5 — 10 куб. см надосадочной жидкости через сухой метанол-совместимый фильтр (0,45 мкм) в сосуд с завинчивающейся крышкой (виалу) и плотно закупоривают. Экстракт необходимо использовать в течение 2 — 3 ч, в противном случае, хранить при температуре -10...-20 °С в плотно закрытой емкости.

Образцы экстрактов вводятся в систему либо непосредственно после фильтрации неочищенного экстракта, либо очищения его на патронах твердофазной экстракции. Это обеспечивает выделение домоевой кислоты и родственных компонентов из экстракта.

Условия для патрона для твердофазной экстракции: пропускают 6 куб. см метанола, затем 3 куб. см воды и 3 куб. см экстрагирующего раствора (метанол:вода — 1:1) через патрон перед его использованием либо проверкой. Патрон не должен высыхать ни на каком этапе процедуры.

Очистка на патроне твердофазной экстракции: помещают 2,0 куб. см отфильтрованной надосадочной жидкости на поверхность патрона и дают медленно стекать (1 капля/с). Останавливают ток, как только мениск образца достигнет верхней точки упаковки патрона. Промывают патрон (1 капля/с) 2 куб. см раствора для промывания (ацетонитрил:вода — 1:9). Останавливают ток, как только мениск образца достигнет верхней точки упаковки патрона. Добавляют 0,5 куб. см цитратного буферного элюента и осторожно позволяют стекать до момента, пока мениск образца не достигнет верхней точки упаковки патрона. Помещают виалу для сбора элюата под патрон. Элюируют домоевую кислоту 2 куб. см цитратного буфера.

Перед отбором аликвоты полученный раствор размешать. Образцы должны быть использованы как можно быстрее либо храниться в тщательно закрытой емкости в холодильнике, не замораживая, в течение 1 недели.

9. Условия хроматографирования (ВЭЖХ)

В жидкостной хроматограф с колонкой (ODS, С ) 5 мкм (250 х 4,6 мм), 18

УФ-детектором  при  лямбда  =  242  нм, температура колонки 40 °С; скорость
потока  мобильной  фазы 1,0 - 1,5 куб. см/мин.; петля 20 куб. мм, используя

градиент мобильной фазы вода — ацетонитрил — метанол (см. п. 7.1.1) вводят 20 куб. мм стандартного раствора домоевой кислоты. В тех же условиях вводят экстракт образца (морепродукта).

10. Построение калибровочной кривой

На рис. 1 представлена градуировочная характеристика, выражающая зависимость площади хроматографического пика от концентрации домоевой кислоты в растворе.

11. Обработка результатов

11.1. За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Окончательный результат округляют до второго десятичного знака.

Содержание домоевой кислоты в пробе рассчитывают по формуле:

                     Х = S     / S    х С    / М х V,
                          обр.    ст.    ст.

где:
Х - содержание домоевой кислоты в пробе, мкг/г;
S     - площадь пика образца, кв. см;
 обр.
S    - площадь пика стандарта, кв. см;
 ст.
С    - концентрация стандарта, мкг/куб. см;
 ст.
М - навеска образца, г;
V - конечный объем разведенной пробы, куб. см.

Статистический параметр	Значения
Нижний предел определения, мкг/г	0,5
Интервал надежного определения, мкг/г	0,5 — 200,0
Среднее значение открываемости (показатель правильности), %	80
Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений ДК, полученными в одной лаборатории в одной серии измерений (сходимость), при Р = 0,95%, не должно превышать, %	7,0
Допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений ДК, выполненных в двух разных лабораториях (воспроизводимость), при Р = 0,95%, не должно превышать по отношению к среднему, %	10

11.2. Если расхождение результатов двух параллельных определений (сходимость и воспроизводимость) превышает требования, указанные в таблице, то повторно проводят два новых параллельных определения.

---