МУК 4.1.2170-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Прометрина в семенах кориандра методом газожидкостной хроматографии. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2007)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ введен в действие с 1 мая 2007 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека
Г. Г. Онищенко
15 февраля 2007 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ, ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРОМЕТРИНА В СЕМЕНАХ КОРИАНДРА МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МУК 4.1.2170-07
1 мая 2007 года
1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах кориандра массовой концентрации Прометрина в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.
Прометрин — действующее вещество препарата Гезагард, СК (500 г/л), фирма-производитель: Сингента, Швейцария.
Название действующего вещества по ИСО: Прометрин.
2 4 Название действующего вещества по ИЮПАК: N ,N -диизопропил-6-метилтио-
1,3,5-триазин-2,4-диамин.
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H № S. 10 19 5
Химически чистый Прометрин представляет собой белое кристаллическое вещество без запаха.
Температура плавления 118 — 120 °С.
Коэффициент распределения н-октанол - вода: K log P = 3,1. ow ow
Растворимость в воде составляет 33,0 мг/куб. дм при 25 °С и рН 7,0.
Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм при 20 °С): ацетон — 300,0; гексан — 6,3; этанол — 140,0; толуол — 200,0; н-октанол — 110,0.
Прометрин стабилен в водных растворах в нейтральной, слабощелочной и слабокислой среде, быстро гидролизуется сильными кислотами и щелочами.
Период полураспада в почве в полевых условиях от 14 до 158 дней (в среднем 50 дней). Основным путем разложения вещества в почве является микробиологическое деалкилирование и окисление метилтио-группы.
Краткая гигиеническая характеристика:
Прометрин относится к малоопасным веществам по острой оральной (ЛД 50 (крысы) 5233 мг/кг), дермальной (ЛД (крысы) свыше 3100 мг/кг) токсичности 50 и умеренно опасным по ингаляционной (ЛД (крысы) более 5170 мг/куб. м) 50 токсичности. Может оказывать побочные неблагоприятные токсикологические эффекты.
В России установлены следующие гигиенические нормативы:
МДУ в зерне кукурузы, гороха, фасоли, чечевицы, семенах и масле подсолнечника и сои, клубнях картофеля, в тмине, кориандре и чесноке — 0,1.
Прометрин — гербицид из группы производных 1,3,5-триазина системного почвенного действия с длительным защитным эффектом, может проникать через листья растений, передвигаясь по ксилеме. Высокоэффективен против малолетних злаковых и двудольных сорняков в период их прорастания в посевах хлопчатника, зернобобовых, подсолнечника, сои, моркови и других зонтичных. Широко используется для приготовления смесевых промышленных препаратов.
Зарегистрирован под торговой маркой Гезагард СК (500 г/л) в России в качестве гербицида для подавления сорняков в посевах подсолнечника, сои, зернобобовых, лекарственных кормовых бобовых культур, моркови и других зонтичных, чеснока, посадках картофеля с нормой расхода 2 — 5 кг/га, однократная обработка.
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, Р = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Кориандр, семена | более 0,10 до 0,5 | 25 | 3,5 | 10 | 12 |
| от 0,05 до 0,1 вкл. | 50 | 4,8 | 13 | 16 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Семена кориандра | 0,05 | 0,05 — 0,5 | 82,6 | 0,95 | 1,64 |
Метод основан на определении Прометрина методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора после экстракции веществ органическим растворителем, очистки экстрактов путем перевода соединений в ионизированную форму, последующего перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями и дополнительной очистки на колонках с Флоризилом.
В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается использованием избирательного термоионного детектора и капиллярной колонки с программированием температуры.
3.1 Средства измерений
Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е.
Весы лабораторные технические ВЛТК-500, ГОСТ 7328.
Колбы мерные вместимостью 10, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Микрошприц Гамильтон вместимостью 10 куб. мм.
Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.
Хроматограф газовый «Кристалл 2000м» с термоионным детектором (ТИД) с -13 пределом детектирования по азоту в азобензоле 5 х 10 г/куб. см и приспособлениями для капиллярной колонки.
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 1770.
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Аналитический стандарт Прометрина с содержанием 95,0% д.в. (фирма Сингента).
Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.
Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83.
Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.
н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.
Гелий очищенный марки «А», ТУ-51-940-80.
Кислота хлороводородная 0,1 н водный раствор.
Кислота хлороводородная конц., х.ч., ГОСТ 3118-77.
Натрия гидроокись, х.ч., ГОСТ 4328-77.
Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.
Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 — 80 меш, фирма «Мерк».
Хлористый метилен, х.ч., ГОСТ 19433-88.
Этилацетат, х.ч., ГОСТ 22300-76.
Эфир диэтиловый (для наркоза, Фармакопея СССР).
Стандартный раствор Прометрина в ацетоне — 1 мг/куб. см (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3 Вспомогательные устройства, материалы
Аппарат для встряхивания проб АВУ-1, ТУ 64-1-1081-73.
Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. № 3120-0250, NALGENE.
Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.
Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.
Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480.
Концентраторы грушевидные на 100 и 250 куб. см, НШ 29 КГУ — 100 (250), ГОСТ 10394-72.
Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма J&W Scientific.
Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.
Фильтры бумажные «красная лента», ТУ 6-09-2678-77.
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.
К подготовке проб допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. ПОДГОТОВКА К ВЫПОЛНЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЙ
7.1 Подготовка хроматографических колонок
для очистки экстракта
7.1.1. Подготовка хроматографической колонки, заполненной Флоризилом, для очистки проб семян кориандра.
На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 10 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 5 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. За день до очистки экстракта колонку промывают последовательно 15 куб. см этилацетата и 10 куб. см гексана, смывы отбрасывают. После промывки колонка готова к работе.
7.1.2. Проверка хроматографического поведения Прометрина на колонках с Флоризилом.
При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Прометрина на колонке. В концентратор помещают 1 куб. см стандартного раствора Прометрина в ацетоне с концентрацией 2,5 мкг/куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе. Далее растворяют стандарт в 1 куб. см этилацетата, добавляют 4 куб. см гексана, перемешивают содержимое концентратора и наносят на колонку. Промывают колонку 15 куб. см гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 20 куб. см смеси гексан:этилацетат — 3:2, отбирая последовательно по 5 мл элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха.
Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм. По результатам обнаружения Прометрина в каждой фракции определяют объем смеси гексан:этилацетат — 3:2, необходимый для полного вымывания Прометрина.
7.2 Приготовление рабочих растворов
7.2.1 Приготовление 0,1 н раствора хлороводородной кислоты.
Раствор готовят из химически чистой концентрированной кислоты с плотностью 1,19 путем разведения 8,2 куб. см концентрированной кислоты дистиллированной водой в мерной колбе на 1 куб. дм.
7.2.2 Приготовление 1 н раствора гидроокиси натрия.
Навеску гидроокиси натрия 40 г растворяют в дистиллированной воде в стакане емкостью 500 куб. см, переливают раствор в мерную колбу емкостью 1 куб. дм. Стакан ополаскивают 400 куб. см дистиллированной воды, воду сливают в ту же колбу. После охлаждения раствора доводят его уровень до метки дистиллированной водой.
7.3 Приготовление стандартных растворов
50 мг Прометрина (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор № 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.
Методом последовательного разбавления исходного раствора № 1 ацетоном готовят рабочие растворы Прометрина с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/куб. см (для построения калибровочного графика) и с концентрацией 0,25; 0,50; 1,25; 2,5 мкг/куб. см (для внесения в образцы), которые могут храниться в холодильнике не более 30 суток.
7.4 Построение градуировочного графика
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Прометрина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/куб. см.
В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Прометрина в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 — не приводится).
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», № 2051-79 от 21.08.79, а также с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и отбора проб».
Пробы семян кориандра подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в течение 6-ти месяцев в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
9.1 Семена кориандра
9.1.1 Экстракция Прометрина из анализируемой пробы.
Навеску 5 г измельченных семян кориандра помещают в полипропиленовые банки объемом 250 куб. см, смачивают 10 куб. см дистиллированной воды и выдерживают 15 мин. После этого в банку приливают 50 куб. см ацетонитрила и встряхивают в течение 30 мин. По окончании встряхивания экстракт фильтруют в концентратор емкостью 250 куб. см через стеклянную воронку с бумажным фильтром. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя каждый раз по 30 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь в течение 30 мин. Экстракты отфильтровывают в тот же концентратор. Содержимое концентратора выпаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка при температуре не выше 40 °С.
К водному остатку в концентраторе добавляют 50 куб. см 0,1 н раствора хлороводородной кислоты, перемешивают содержимое концентратора и переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. Концентратор обмывают 50 куб. см дистиллированной воды, смыв сливают в делительную воронку.
Приливают в делительную воронку 20 куб. см смеси гексан:эфир — 7:1, содержимое воронки встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев нижний водный слой сливают в стакан емкостью 200 куб. см, смесь растворителей отбрасывают. Содержимое стакана возвращают в делительную воронку и еще раз промывают 20 куб. см этой же смеси.
Водную фракцию в стакане подщелачивают 1 н раствором гидроокиси натрия до рН = 8 и переносят в делительную воронку.
Далее в делительную воронку добавляют 30 куб. см хлористого метилена и встряхивают содержимое воронки в течение 1 — 2 минут. После расслоения фаз нижний слой хлористого метилена сливают через воронку с безводным сульфатом натрия в концентратор емкостью 250 куб. см. Повторяют переэкстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см хлористого метилена. Хлористый метилен выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С.
9.1.2 Очистка экстракта на колонке с Флоризилом.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см этилацетата, добавляют 4 куб. см гексана, тщательно обмывают концентратор и наносят содержимое концентратора на колонку с Флоризилом, подготовленную, как указано в разделе 7.1.1. Промывают колонку 15 куб. см гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 5 куб. см смеси гексан:этилацетат — 3:2, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 15 куб. см той же смеси, собирая элюат в концентратор емкостью 100 куб. см. Содержимое концентратора выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха.
Сухой остаток в концентраторе растворяют в 2,5 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм.
9.2 Условия хроматографирования
Хроматограф «Кристалл 2000м» с термоионным детектором с пределом -13 детектирования по азоту в азобензоле не выше 5 х 10 или другой с аналогичными характеристиками.
Капиллярная кварцевая колонка НР-5, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм.
Температура термостата колонки программированная: начальная температура — 160 °С, выдержка 2 минуты, нагрев колонки по 30 °С в минуту до 250 °С, выдержка 5 мин.
Продувка детектора и испарителя после анализа азотом — по 65 мл/мин. в течение 3 минут. Нагрев колонки до 280 °С.
Температура испарителя — 260 °С, детектора — 350 °С.
Регулятор расхода гелия — РРГ-11; режим — Split less.
Газ 1 — гелий, линейная скорость — 20 см/сек., давление на входе — 27,29 кПа.
Газ 2 — гелий (продувка испарителя), расход — 1,0 куб. см/мин.; сброс 1:50.
Газ 3 — азот (поддув в детектор), расход во время анализа — 40 куб. см/мин.
Расход водорода — 16 куб. см/мин., воздуха — 200 куб. см/мин.
Абсолютное время удерживания Прометрина — 4 мин. 20 сек. — 4 мин. 23 сек.
Минимально детектируемое количество Прометрина в анализируемом объеме — 0,1 нг.
Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,1 — 1,0 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Прометрина 1,0 мкг/куб. см соответственно, разбавляют.
Для определения содержания Прометрина в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:
Sпр х А х V
Х = ------------- х Р, 100 х Sст х m
Х — содержание Прометрина в пробе, мг/кг;
Sст — площадь пика стандарта, мВ;
Sпр — площадь пика образца, мВ;
А — концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г;
Р — содержание Цимоксанила в аналитическом стандарте, %.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;
1 2
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде:
_
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/кг; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг» <*>.
<*> 0,05 мг/кг — предел обнаружения.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;
_
дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11), содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
таблица 1), %.
ФГОУ ВПО Российский Государственный Аграрный Университет — МСХА имени К.А. Тимирязева.
Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов».