МУК 4.1.2140-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств бромадиолона в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 04.12.2006)
Примечание
Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 1 марта 2007 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
4 декабря 2006 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БРОМАДИОЛОНА В ВОДЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
1 марта 2007 года
1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации бромадиолона в воде в диапазоне 0,0005 — 0,01 мг/куб. дм.
Бромадиолон — действующее вещество препарата БРОМ-БД, концентрат (2,5 г/кг); фирма ООО «Валбрента Кемикалс».
3-[3-(4'-Бромбифенил-4-ил)-3-гидрокси-1-фенилпропил]-4-гидроксикумарин (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
C H BrO . 30 23 4
Бромадиолон - белое порошкообразное вещество без запаха (технический продукт бледно-желтый). Температура плавления 200 - 210 °С (смесь диастереоизомеров). Давление паров при 20 °С - 0,002 мПа. Растворимость в органических растворителях при 20 °С (в г/куб. дм): диметилформамид - 730; этилацетат - 25; этанол - 8,2. Растворим в ацетоне, слабо растворим в хлороформе, практически не растворим в диэтиловом эфире и гексане.
Растворимость в воде (при 20 °С) — 19 мг/куб. дм. Коэффициент распределения н-октанол/вода: К log Р = 3,5. Термически стабилен до 200 °С. ow
Краткая токсикологическая характеристика
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 1,125 мг/кг; мышей — 50
1,75 мг/кг; кроликов - 1,00 мг/кг; кошек - > 25 мг/кг; собак - > 10,0 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов 1,71 мг/кг; острая
50
ингаляционная токсичность (LC ) — 0,43 мг/куб. дм. 50
Бромадиолон — родентицид антикоагулянтного типа класса кумаринов, предназначенный для приготовления отравленных пищевых приманок для борьбы с вредными полевыми и домашними грызунами внутри жилых и нежилых помещений. Является антикоагулянтом второго поколения с отсроченным сроком действия.
Выпускается в виде 0,25%-ного концентрата.
Рекомендуемая ПДК в воде водоемов 0,001 мг/куб. дм.
1. Метрологические характеристики
При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.
| Анализируемый объект | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (куб. дм) | Показатель точности (граница относительной погрешности), +/- дельта, %, Р = 0,95 | Стандартное отклонение повторяемости, сигма , % r | Предел повторяемости, r, % | Предел воспроизводимости, R, % |
| Вода | от 0,01 до 0,001 вкл. | 100 | 3,7 | 10 | 13 |
| менее 0,001 до 0,0005 | 150 | 4,2 | 12 | 15 |
Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.
| Анализируемый | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | ||||
| объект | Предел обнаружения, мг/куб. дм | Диапазон определяемых концентраций, мг/куб. дм | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % |
| Вода | 0,0005 | 0,0005 — 0,01 | 83,1 | 3,7 | 2,0 |
Метод основан на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Для концентрирования и очистки проб воды использованы патроны для твердофазной экстракции Sep Pak С18.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
3.1 Средства измерений
Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым Номер в Государственном детектором с переменной длиной волны реестре средств измерений (фирмы Waters, США) 15311-02
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения с ГОСТ 7328 наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г
Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см
Пробирки градуированные с пришлифованной ГОСТ 1770 пробкой вместимостью 5 куб. см
Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770 вместимостью 25, 50, 100, 250 и 1000 куб. см
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Бромадиолон технический с содержанием основного вещества не менее 98,1% (фирмы ООО «Валбрента Кемикалс»)
Кислота орто-фосфорная, хч, 85% ГОСТ 6552
Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3 Вспомогательные устройства, материалы
Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)
Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные или ТУ 6-09-2678-77 фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ
Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336
Колбы плоскодонные вместимостью 100, 250, ГОСТ 9737 400 — 500 куб. см
Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 10696
Стаканы химические вместимостью 100 и 250 куб. см ГОСТ 25336
Патроны для твердофазной экстракции Sep Pak С18 Cartridges (фирмы Waters, США)
Установка для перегонки растворителей
Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry(R) С18, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм
Шприцы медицинские с разъемом Льюера ГОСТ 22090 вместимостью 5 и 20 куб. см
Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
5. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
7. Подготовка к выполнению измерений
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка метанола перегонкой с дефлегматором (при необходимости), приготовление раствора орто-фосфорной кислоты, градуировочных растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Sep Pak С18.
7.1 Приготовление 0,02 М раствора орто-фосфорной кислоты
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 1,36 куб. см 85%-ной орто-фосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.
7.2 Подготовка концентрирующего патрона Sep Pak С18
Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 — 2 капли в сек., затем 5 куб. см деионизованной воды. Патрон готовят непосредственно перед использованием для концентрирования образца.
7.3 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 170 куб. см бидистиллированной или деионизированной воды, 1,0 куб. см орто-фосфорной кислоты, 830 куб. см метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.
7.4 Кондиционирование хроматографической колонки
Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.
7.5 Приготовление градуировочных растворов
и раствора внесения
7.5.1 Исходный раствор бромадиолона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,0100 г бромадиолона, добавляют 50 — 70 куб. см метанола, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. для растворения, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.
Растворы № 1 — 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.
7.5.2 Раствор № 1 бромадиолона для градуировки и внесения (концентрация 5 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 5 куб. см исходного градуировочного раствора бромадиолона с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют метанолом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.
Раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.
7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 6 бромадиолона для градуировки (концентрация 0,025 — 0,5 мкг/куб. см)
В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 5 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.3), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией бромадиолона 0,025; 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в холодильнике в течение 2-х недель.
7.6 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей пиков диастереоизомеров бромадиолона (отн. единицы) от концентрации вещества в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки № 2 — 6.
В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают сумму площадей пиков диастереоизомеров действующего вещества.
Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2-х растворов для градуировки различной концентрации. Если значения суммы площадей отличаются более чем на 11% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.1979).
Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °С в течение 3-х недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °С.
Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.
9.1 Концентрирование и очистка пробы
Образец отфильтрованной воды объемом 200 куб. см, помещенный в химический стакан вместимостью 250 — 300 куб. см, вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон Sep Pak С18, подготовленный по п. 7.2, со скоростью пропускания раствора 1 — 2 капли в сек. После завершения концентрирования пробы патрон промывают последовательно тремя порциями по 5 куб. см смеси вода — метанол в следующем объемном соотношении 9:1, затем 7:3 и 1:1, далее 5 куб. см смеси метанол — 0,02 М — орто-фосфорная кислота (1:1, по объему), элюаты отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 4 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.3, собирая элюат в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание бромадиолона по п. 9.2.
9.2 Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
Жидкостной хроматограф «Breeze» с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США)
Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry(R) С18, зернением 5 мкм
Температура колонки: комнатная
Подвижная фаза: метанол — вода — орто-фосфорная кислота (83:17:0,1, по объему)
Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.
Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу
Объем вводимой пробы: 20 куб. мм
Ориентировочное время выхода бромадиолона (2 диастереоизомера):
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор бромадиолона с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.3).
10. Обработка результатов анализа
Содержание бромадиолона в пробе воды (Х, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:
А х V
А — концентрация бромадиолона, найденная по градуировочному графику в соответствии с суммой площадей пиков диастереоизомеров, мкг/куб. см;
V — объем раствора, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
W — объем анализируемого образца воды, куб. см.
параллельных определений
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= r, (1)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты параллельных определений, мг/куб. дм;
1 2
r — значение предела повторяемости (таблица 1), при этом r = 2,8 сигма . r
При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
Результат анализа представляют в виде: _
(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/куб. дм, при вероятности Р = 0,95,
где:
_
Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных
приемлемыми, мг/куб. дм; ДЕЛЬТА — граница абсолютной погрешности, мг/куб. дм;
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«содержание вещества в пробе менее 0,0005 мг/куб. дм» <*>.
13. Контроль качества результатов измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность (прецизионность) методов и результатов измерений».
13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.
13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.
Величина добавки С должна удовлетворять условию: д
С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ , д л,Х л,Х' где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности л,Х л,Х' (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента
в образце с добавкой соответственно), мг/куб. дм, при этом:
где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/куб. дм;
где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель
точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.
Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле: к
_ _ К = Х' - Х - С , к д _ _ где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных
д
определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/куб. дм.
Норматив контроля К рассчитывают по формуле:
_____________________
/ 2 2 К = \/ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _. л,Х' л,Х Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом
к
контроля (К).
Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:
процедуру анализа признают удовлетворительной.
При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.
13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:
Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):
2 х |Х - Х | х 100
1 2
------------------- <= R, (3)
(Х + Х )
1 2
где:
Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/куб. дм;
1 2
R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,
таблица 1), %.
Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.