МУК 4.1.2069-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств дитианона в винограде, виноградном соке, персиках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 05.05.2006)

5 мая 2006 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИТИАНОНА В ВИНОГРАДЕ, ВИНОГРАДНОМ СОКЕ, ПЕРСИКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.2069-06

1 июля 2006 года

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в ягодах винограда, виноградном соке, персиках массовой концентрации дитианона в диапазоне 0,02 — 0,2 мг/кг.

Дитианон — действующее вещество препарата ДЕЛАН, СК (750 г/л), фирма-производитель БАСФ, Германия.

5,10-дигидро-5,10-диоксонафто[2,3-b]-1,4-дитиин-2,3-дикарбонитрил (IUPAC).

Структурная формула не приводится.

C H № O S 14 4 2 2 2

Мол. масса 296,3.

Твердое вещество темно-коричневого цвета без запаха. Температура -6

плавления  225 °C. Давление паров при 25 °C: 2,7 x 10   мПа. Плотность 1576
кг/куб.  м.  Растворимость  в  органических растворителях при 20 °C (г/куб.
дм):  хлороформ - 12, бензол - 8, ацетон - 10; слабо растворим в метаноле и

дихлорметане. Растворимость в воде при 20 °C — 0,14 мг/куб. дм. Разрушается

в   щелочной   среде,  концентрированных  кислотах  и  при  продолжительном
нагревании;  DT    -  12,2  часа (pH 7, 25 °C). Быстро разрушается в воде с

           50

большим содержанием органических веществ. Период полураспада в воде — приблизительно 1 день.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 678 мг/кг, для мышей — 50 511 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс — 2000 мг/кг, для 50 мышей — 3200 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK ) для крыс — 50 более 2086 мг/куб. м. Препарат раздражает кожу, особенно слизистые оболочки глаз.

Область применения препарата

Делан — фунгицид широкого спектра действия из класса хинонов, применяется на фруктовых, цитрусовых культурах, винограде, хмеле, кофе, пшенице и декоративных растениях в период после цветения.

МДУ в персиках, рекомендуемый ВМДУ в винограде — не допускается.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 24
	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	доверительный интервал среднего результата, %
Виноград (ягоды)	0,02	0,02 — 0,2	78,70	2,16	+/- 2,5
Виноградный сок	0,02	0,02 — 0,2	86,75	3,53	+/- 4,1
Персики	0,02	0,02 — 0,2	80,73	2,35	+/- 2,7

Таблица 2

ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено дитианона, мг/кг	Обнаружено дитианона, мг/кг (куб. дм)	Полнота извлечения, %
1	2	3	4
Виноград (ягоды)	0,02 0,04 0,1 0,2	0,015616 +/- 0,000784 0,031586 +/- 0,001013 0,079071 +/- 0,002702 0,157054 +/- 0,006983	78,08 78,96 79,07 78,53
Виноградный сок	0,02 0,04 0,1 0,2	0,017009 +/- 0,001173 0,034413 +/- 0,003989 0,085961 +/- 0,008039 0,179102 +/- 0,019614	85,04 86,03 85,96 89,55
Персики	0,02 0,04 0,1 0,2	0,016254 +/- 0,001400 0,032274 +/- 0,002033 0,080450 +/- 0,006977 0,161075 +/- 0,012963	81,27 80,68 80,45 80,54

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы растительного материала ацетонитрилом в кислой среде, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания винограда и персиков.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США) Номер Госреестра 15945-97

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 7328

Колбы мерные вместимостью 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 куб. см ГОСТ 29227

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50, 100, 250, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Дитианон с содержанием действующего вещества 98,0% (фирмы «БАСФ»)

Ацетонитрил для хроматографии, х.ч. ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над KMnO 4

Кислота хлороводородная (соляная), х.ч. ГОСТ 6552

Кислота уксусная ледяная, х.ч. ГОСТ 61

Метилен хлористый (дихлорметан), х.ч. ГОСТ 12794

Натрий сернокислый, безводный, х.ч. ГОСТ 4166

Силикагель 60 (0,2 — 0,5 мм) для колоночной хроматографии (фирмы Мерк)

Хлороформ Фармакопея СССР

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

    Бумажные фильтры "красная лента", обеззоленные      ТУ 6-09-2678-77
    Воронка Бюхнера                                     ГОСТ 0147

Воронки делительные вместимостью 500 и 1000 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Гомогенизатор ГОСТ 15906

Груша резиновая

Колба Бунзена ГОСТ 56145

Колбы плоскодонные вместимостью 200 — 250 куб. см ГОСТ 9737

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 и 250 куб. см ГОСТ 9737

Колонка стеклянная внутренним диаметром 15 мм, высотой 25 см

Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм

Насос водоструйный ГОСТ 10696

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель B-169 фирмы Buchi, Швейцария ТУ 25-11-917-74

Стаканы химические вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336

Стекловата

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Холодильник водяной обратный ГОСТ 23932

Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С18, зернением 8 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, элюента для колоночной хроматографии, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с силикагелем.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2 Очистка хлороформа и дихлорметана

Хлороформ (дихлорметан) промывают последовательно 5% водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2. Приготовление элюента для колоночной хроматографии

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 — 600 куб. см хлороформа, вносят 1 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят до метки хлороформом, тщательно перемешивают.

7.3. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 640 куб. см ацетонитрила, 2 куб. см уксусной кислоты, добавляют 360 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.4. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.3) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.5. Приготовление градуировочных растворов

7.5.1. Исходный раствор дитианона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г дитианона, растворяют в 50 — 70 куб. см ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Градуировочные растворы № 2 — 5 дитианона готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.5.2. Раствор № 1 дитианона для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике не более 5-ти дней.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения дитианона из исследуемых образцов.

7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 5 дитианона для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией дитианона 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/куб. см, соответственно. Растворы хранятся в холодильнике не более 3-х дней.

7.6. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации дитианона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.7. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 15 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 10 г силикагеля в 20 куб. см хлороформа. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 50 куб. см элюента для колоночной хроматографии (приготовленного по п. 7.2) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Колонка готова к работе.

7.8. Проверка хроматографического поведения дитианона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см градуировочного раствора № 5 с концентрацией дитианона 1 мкг/куб. см. Упаривают растворитель досуха, остаток растворяют в 2 куб. см элюента для колоночной хроматографии (приготовленного по п. 7.2) и вносят в подготовленную колонку.

Промывают колонку 150 куб. см элюента (приготовленного по п. 7.2) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают (предварительно внеся в каждую колбу для упаривания 0,1 куб. см уксусной кислоты), остатки растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и анализируют содержание дитианона по п. 9.4.

Фракции, содержащие дитианон, объединяют вместе в колбе для упаривания (содержащей 0,1 куб. см уксусной кислоты), упаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.3 и вновь анализируют содержание дитианона по п. 9.4.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения дитианона следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб осуществляется по требованиям ГОСТ на соответствующий вид продукции: виноград - ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия»; ГОСТ 28472-90 «Виноград ручной уборки для консервирования. Технические условия»; виноградный сок - ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб»; персики - ГОСТ 21833-76 «Персики свежие. Технические условия».

Отобранные пробы ягод винограда, виноградного сока, персиков замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы персиков и ягод винограда измельчают для приготовления усредненной пробы.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Аналитический образец измельченных ягод винограда, персиков, виноградного сока массой 20 г помещают в химический стакан вместимостью 400 куб. см, вносят 40 куб. см ацетонитрила и 20 куб. см соляной кислоты, гомогенизируют в течение 1-й минуты. Смесь охлаждают до 4 — 6 °C, помещая в холодильную камеру на 30 — 40 мин., затем фильтруют с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на воронке Бюхнера через двойной слой бумажного фильтра. Остаток ягод винограда на фильтре возвращают в стакан для экстракции, вносят 30 куб. см ацетонитрила, вновь гомогенизируют 1 мин. и фильтруют на воронке Бюхнера. После фильтрования виноградного сока фильтр с осадком промывают 20 куб. см охлажденного (6 — 8 °C) ацетонитрила.

Объединенные экстракт и промывку переносят в делительную воронку вместимостью 500 куб. см и очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К экстракту, полученному по п. 9.1, помещенному в делительную воронку вместимостью 500 куб. см, добавляют 150 куб. см дихлорметана, интенсивно встряхивают в течение 5-ти мин. После полного разделения фаз нижний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помешенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см.

Операцию экстракции водной фазы повторяют, используя 30 куб. см хлористого метилена и встряхивая 3 мин. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха при температуре не выше 40 °C и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5-ти куб. см смеси хлороформ-уксусная кислота в соотношении 999:1, по объему (элюент для колоночной хроматографии, приготовленный по п. 7.2) и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают трижды этой же смесью порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 130 куб. см элюента со скоростью 1 — 2 капли в сек., первые 30 куб. см элюата отбрасывают, остальные 100 куб. см собирают в круглодонную колбу, содержащую 0,1 куб. см уксусной кислоты. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °C, остаток в колбе растворяют в 4-х куб. см подвижной фазы и анализируют содержание дитианона по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-уксусная кислота (640:360:2, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 254 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода дитианона: 7,6 — 7,9 мин.

Линейный диапазон детектирования 2 — 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор дитианона с концентрацией 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.3).

10. Обработка результатов анализа

Содержание дитианона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                                C x V

X = -----, G

где:

X — содержание дитианона в пробе, мг/кг;

C — концентрация дитианона в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

G — масса анализируемого образца, г.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики

ФГУН «ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора»; Роспотребнадзор.

---