МУК 4.1.2063-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств триасульфурона в зерне хлебных злаков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 05.05.2006)

5 мая 2006 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТРИАСУЛЬФУРОНА В ЗЕРНЕ ХЛЕБНЫХ ЗЛАКОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.2063-06

1 июля 2006 года

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Торговое наименование: Дукат.

Фирма-регистрант: ООО НПП «Агрусхим».

Действующее вещество: триасульфурон.

Структурная формула (не приводится).

1-[2-(2-хлорэтокси)фенилсульфонил]-3-(6-метил-4-метокси-1,3,5-триазин-2-ил)мочевина (IUPAC).

2-(2-хлорэтокси-[[(6-метил-4-метокси-1,3,5-триазин-2-ил)амино]карбонил]бензолсульфонамид (CA).

Мол. масса: 401,8.

    Брутто-формула: C  H  ClN O S.
                     14 16   5 5
    Химически  чистый  триасульфурон  представляет  собой  белый  порошок с

                                                     -3

температурой плавления 178,1 °C, давлением паров < 2 x 10   мPa (25 °C).
    Коэффициент  распределения  в системе н-октанол-вода K   lg P = 1,1 (pH

                                                      ow

5), -0,59 (pH 7), -1,8 (pH 9) (25 °C).

Растворимость (г/куб. дм): в воде 0,032 (pH 5), 0,815 (pH 7), 13,5 (pH 8,4) при 25 °C;

дихлорметане — 36, ацетоне — 14, этилацетате — 4,3, этаноле — 0,42, толуоле — 0,3, н-октаноле — 0,13, гексане — 0,00004 (25 °C).

Стабилен на воздухе до 140 °C, в нейтральных и щелочных растворах при 25 °C.

Группа токсичности по ЕПА — IV, ВОЗ — U. Острая пероральная токсичность LD для крыс и мышей > 5000 мг/кг. Дермальная токсичность для крыс > 2000 50 мг/кг.

Область применения: селективный гербицид, адсорбируется листьями, корнями и быстро попадает в меристему. Используется для контроля широколиственных сорняков на зерновых. Гигиенические нормативы для триасульфурона в России: МДУ в зерне хлебных злаков — 0,1 мг/кг.

2. Методика определения триасульфурона в зерне хлебных злаков методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1 Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств триасульфурона в пробах зерна хлебных злаков в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.

Методика основана на определении триасульфурона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Диапазон определяемых концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг.

Нижний предел определения триасульфурона в зерне 0,01 мг/кг.

Полнота определения 80% (коэффициент извлечения K = 0,8).

Границы суммарной относительной погрешности результата измерений ДЕЛЬТА +/- 12% при доверительной вероятности P = 0,95 (n = 20).

Полнота определения триасульфурона в зерне зерновых колосовых культур (N = 5 для каждой концентрации):

2.1.3 Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калий фосфорнокислый 2-замещенный, 3-водный, ч.д.а., ГОСТ 2493-75.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или х.ч., ГОСТ 6552-80; 2 М и 0,005 М водные растворы.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Трибенурон-метил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,2% (Sigma-Aldrich).

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

    Подвижная  фаза  для  ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,01 М H PO  (35:65, по
                                                            3  4

объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 — 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (50:50, по объему).

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (10:90, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф LC-10A фирмы Shimadzu с УФ-детектором (SPD-10A) или другой с аналогичными характеристиками.

Аналитическая колонка Supelcosil C-18 (150 x 4,6) мм, 5 мкм (Sigma-Aldrich).

Предколонка Supelcosil C-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001 или аналогичные.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

PH-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 x 1) см.

Допускается применять другое вспомогательное оборудование, материалы и реактивы с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) «Зерновые. Отбор проб зерна». Пробы зерна для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом зерно доводят до стандартной влажности и измельчают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

    Перед   началом  работы  рекомендуется  проверить  чистоту  применяемых
органических  растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя упаривают в
ротационном  испарителе  при  температуре  40 °C  до  объема  1,0 куб. см и
хроматографируют.  При  обнаружении  мешающих  определению примесей очистку
растворителей  производят  в  соответствии  с типовыми методиками. Гексан и
хлористый  метилен  встряхивают  с  небольшими  порциями  концентрированной
серной  кислоты  до  прекращения  окрашивания  свежей порции кислоты, затем
промывают  водой,  2%  раствором  гидроксида  натрия  и  снова водой, после
чего  его  сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над
перманганатом  калия  и  поташом  (на  1  куб.  дм ацетона 10 г KMnO  и 2 г

                                                                4

K CO ).  Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный
 2  3
растворитель   повторно   перегоняют   над  углекислым  калием.  Этилацетат
промывают  равным  объемом  5% раствора  двууглекислого  натрия, сушат  над

хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Supelcosil C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.

2.5.3 Приготовление растворов

Для приготовления 2 М раствора ортофосфорной кислоты 200 г 98% (или 225

г  87%)  кристаллической  H PO   помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм,
                           3  4
растворяют  в  600  куб.  см дистиллированной воды и доводят объем до метки

дистиллированной водой.

Для приготовления 0,01 М раствора ортофосфорной кислоты 5,0 куб. см 2 М

раствора  H PO   вносят  в  мерную  колбу  на  1 куб. дм и доводят до метки
           3  4

деионизированным бидистиллятом.

    Для  приготовления  0,2 М раствора K HPO  45,6 г кристаллического калия
                                        2   4
фосфорнокислого  двузамещенного  трехводного  помещают  в мерную колбу на 1

куб. дм, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для получения 50% водного ацетона в колбе емкостью 1 куб. дм смешивают 500 куб. см ацетона с 500 куб. см дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,01 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 35:65 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента № 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см этилацетата. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 100 куб. см н-гексана и 900 куб. см этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску триасульфурона (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/ куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы — смесь ацетонитрил — 0,01 М ортофосфорная кислота (35:65, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При изучении полноты определения триасульфурона используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,2 и 2,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация триасульфурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации триасульфурона в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

2.5.5 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 куб. см элюента № 2 и 50 куб. см элюента № 1 со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения триасульфурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора триасульфурона с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °C), остаток растворяют в 5 куб. см элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента № 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 куб. см элюента № 1, затем 100 куб. см элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, упаривают, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание триасульфурона по п. 2.6.3.

Фракции, содержащие триасульфурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.3. Рассчитывают содержание триасульфурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания триасульфурона и сопутствующих коэкстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Проведение определения

2.6.1 Определение триасульфурона в зерне

Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 20 г помещают

в  коническую  колбу  емкостью  250 куб. см и экстрагируют триасульфурон 50
куб.  см смеси ацетон-вода (1:1, по объему)  на  ультразвуковой установке в
течение  15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента".
Экстракцию   повторяют   дважды  порциями  по  50  куб.  см,  выдерживая  в
ультразвуковой  ванне  каждый  раз  в течение 15 мин. Объединенный экстракт
упаривают  на  ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до
полного  удаления  ацетона.  Объем  водного  остатка доводят до 100 куб. см

дистиллированной водой, добавляют к нему 50 куб. см 0,2 М раствора K HPO . 2 4

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

Объединенный водный экстракт промывают в делительной воронке объемом 500 куб. см дважды гексаном порциями по 50 куб. см (верхний органический слой отбрасывают) и дважды этилацетатом порциями по 50 куб. см (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая каждый раз делительную воронку в течение 2 — 3 мин. Водную фазу подкисляют 2 М ортофосфорной кислотой до pH 3 и триасульфурон экстрагируют этилацетатом трижды по 30 куб. см, встряхивая воронку каждый раз по 2 — 3 мин. <*>. Нижний водный слой отбрасывают. Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 куб. см этилацетата. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.2 <**>.

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку на стадии промывки экстрактов гексаном — небольшое количество (до 10 куб. см) этилового спирта.

<**> В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.1) дает удовлетворительные результаты, дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

2.6.2 Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1 экстрактов зерна, количественно переносят двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 куб. см элюента № 1, которые отбрасывают. Триасульфурон элюируют 80 куб. см элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 куб. см. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф LC-10A фирмы Shimadzu с УФ-детектором (SPD-10A) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 223 нм.

Колонка Supelcosil C-18 (150 x 4,6) мм, 5 мкм (Sigma-Aldrich).

Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.

Температура колонки 30 +/- 1 °C.

    Подвижная  фаза: ацетонитрил - 0,01 М раствор H PO  в соотношении 35:65
                                                   3  4

(по объему).

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Время удерживания триасульфурона 8,3 +/- 0,1 мин.

2.6.4 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание триасульфурона в образце зерна (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                             S  x C x V
                              2

X = ----------, S x P x K 1

где: S — площадь пика триасульфурона в стандартном растворе, мм; 1 S — площадь пика триасульфурона в анализируемой пробе, мм; 2 V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см; P — навеска анализируемого образца, г; C — концентрация стандартного раствора триасульфурона, мкг/куб. см; K — коэффициент извлечения, определяемый в эксперименте по внесению стандартного раствора триасульфурона в контрольный образец зерна.

Содержание остаточных количеств триасульфурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор триасульфурона 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Оформление результатов измерений

Результаты измерений содержания триасульфурона в образцах зерна представляют в виде:

(X +/- ДЕЛЬТА), мг/кг,

где ДЕЛЬТА — показатель точности результатов анализа (границы, в которых погрешность любого из совокупности результатов анализа, полученных при реализации методики, находится с принятой вероятностью P = 0,95).

4. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

5. Требования к квалификации оператора

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

6. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

7. Разработчики

ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург.