МУК 4.1.2061-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств абамектина в ягодах и соке винограда, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 10.04.2006)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АБАМЕКТИНА В ЯГОДАХ И СОКЕ ВИНОГРАДА, ПЕРЦЕ И БАКЛАЖАНАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации абамектина в ягодах и соке винограда, перце и баклажанах в диапазоне 0,002 — 0,05 мг/кг.

Абамектин — действующее вещество инсектицида Вертимек, КЭ (18 г/л), фирма-производитель Сингента Кроп ПротекшН АГ (Швейцария).

    Смесь     5-O-деметилавермектина     A       (авермектин     B  )     и
                                          1a                      1a
5-O-деметил-25-де(1-метил-пропил)-25-(1-метилэтил)авермектина           A

                                                                     1a

(авермектин B ) в соотношении 4:1 (С.А.). 1b

Структурная формула (не приводится).

    Авермектин B   - C  H  O  , мол. масса 873,1.
                1a    48 72 14
    Авермектин B   - C  H  O  , мол. масса 859,1.
                1b    47 70 14

Белое кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления: 161,8 -3

• 169,4 °С (с разложением). Давление паров при 25 °С: < 3,7 х 10 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: К log Р = 4,4. Растворимость ow г/куб. дм) при 20 °С: дихлорметан — 470, этилацетат — 160, ацетон — 72, толуол — 23, метанол — 13, гексан — 0,11, вода — 0,001.

Стабильно при хранении на воздухе, не гидролизуется в водных растворах при pH 5 — 9.

При облучении УФ-светом абамектин превращается в 8,9-Z-изомер.

В биологически активных почвах абамектин прочно связывается и затем быстро разлагается почвенными микроорганизмами.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс и мышей составляет 50 соответственно 10,0 и 13,6 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для 50 кроликов более 2000 мг/кг. Острая пероральная токсичность (LD ) препарата 50 Вертимек, содержащего 1,8% абамектина, составляет 650 мг/кг.

Абамектин слабо раздражает слизистую оболочку глаз кролика.

LC для рыб 3 — 10 мкг/куб. дм (96 час.). Инсектицид нетоксичен для 50

диких  животных, земляных червей и водорослей; токсичен для пчел при прямом
контакте  (LD    =  0,017  -  0,54 мкг/особь), но становится практически не

         50

опасным для них через несколько часов после применения.

Рекомендуемый гигиенический норматив для абамектина в ягодах и соке винограда, перце и баклажанах — 0,005 мг/кг.

Область применения препарата

Абамектин — инсектоакарицид широкого спектра действия, эффективно уничтожает членистоногих, включая клещей и насекомых, на хлопчатнике, сое, овощных и декоративных культурах, семечковых плодовых, картофеле и табаке в течение вегетационного периода.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Вертимек, КЭ (18 г/л) на картофеле, огурцах и томатах защищенного грунта, перце, баклажанах, в яблоневых садах и на виноградниках с нормой расхода препарата до 1,0 л/га при 1 — 2-кратной обработке за сезон.

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Относительное отклонение, DS, %	Доверительный интервал среднего, %
Ягоды винограда	0,002	0,002 — 0,02	82,9	3,9	1,7	+/- 3,6
Сок винограда	0,002	0,002 — 0,02	81,2	4,2	1,9	+/- 4,2
Перец	0,002	0,002 — 0,02	82,9	3,6	1,6	+/- 3,6
Баклажаны	0,002	0,002 — 0,02	82,7	3,8	1,7	+/- 3,7

(n = 5)

Матрица	Внесено абамектина, мг/кг	Открыто абамектина, %	Доверительный интервал среднего, %
Ягоды	0,002	79,4	+/- 3,7
	0,004	82,6	+/- 3,6
	0,01	84,4	+/- 3,2
	0,02	85,2	+/- 2,9
Сок	0,002	78,6	+/- 3,8
	0,004	83,8	+/- 3,3
Перец	0,002	81,8	+/- 4,0
	0,004	84,0	+/- 3,9
Баклажаны	0,002	81,9	+/- 4,6
	0,004	83,5	+/- 4,1

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектором. Контроль абамектина в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из плодов и ягод метанолом, а из сока гексаном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и дериватизации, приводящей к образованию флуорогенного производного абамектина.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3.1 Средства измерений

Жидкостной хроматограф с флуоресцентным Номер Госреестра № детектором (фирма Altex, США)

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим ГОСТ 7328 пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,036 г

Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см

Пробирки градуированные с пришлифованной ГОСТ 1770 пробкой вместимостью 5 куб. см

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью ГОСТ 1770 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Абамектин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 92,4% (Сингента, Швейцария)

Ангидрид трифторуксусной кислоты, ч                      ТУ 6-09-4135-75
Ацетонитрил для хроматографии, хч                        ТУ 6-09-3534-82
Вода бидистиллированная                                  ГОСТ 6702
н-Гексан, хч                                             ТУ 6-09-3375

Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995

N-метилимидазол (Мерк, Германия)

Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ 4166

Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3 Вспомогательные устройства, материалы

Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Co. (США)

Воронка Бюхнера ГОСТ 9147

Воронки делительные вместимостью 100 и 250 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Гомогенизатор МРТУ 42-1505

Дефлегматор елочный ГОСТ 9737

Колба Бунзена вместимостью 500 куб. см ГОСТ 5614

Колбы грушевидные на шлифе вместимостью ГОСТ 9737 50 и 100 куб. см

Колонка хроматографическая стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Диасфер 110-С18, зернением 5 мкм

Насос водоструйный вакуумный                             ГОСТ 10696
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или               ТУ 25-11-917

ротационный вакуумный испаритель В-169 Buchi (Швейцария)

Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см ГОСТ 25336

Установка для перегонки растворителей

Фильтры бумажные «красная лента», обеззоленные ТУ 6-09-2678 или фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ

Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф вместимостью 50 — 100 куб. мм

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, реактива для дериватизации, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1 Очистка органических растворителей

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2 Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2 Приготовление реактива для дериватизации

Смешивают 1 объем свежеперегнанного ангидрида трифторуксусной кислоты и 2 объема свежеперегнанного ацетонитрила. Реактив годен к употреблению в течение рабочего дня.

7.3 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Используемый в качестве подвижной фазы метанол фильтруют через мембранный фильтр.

7.4 Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (метанолом) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.5 Приготовление градуированных растворов

7.5.1 Исходный раствор абамектина для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,011 г абамектина, содержащего 92,4% действующего вещества, растворяют в 40 — 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.5.2 Раствор абамектина № 1 для градуировки (концентрация 1 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного раствора абамектина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов № 2 — 5, а также проб ягод и сока с внесением при оценке полноты извлечения абамектина из исследуемых образцов.

Градуировочный раствор № 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 5 абамектина для градуировки (концентрация 0,01 — 0,1 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 абамектина с концентрацией 1 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией абамектина 0,01; 0,02; 0,05 и 0,10 мкг/куб см соответственно. Растворы хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение недели.

7.6 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации абамектина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

Для построения калибровочного графика в градуированные пробирки вместимостью 5 куб. см вносят по 1 куб. см каждого из 4 градуировочных растворов абамектина (п. 7.5.3) и подвергают дериватизации по п. 9.3. В инжектор хроматографа вводят по 50 куб. мм каждого дериватизированного градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТом 25896-83 «Виноград свежий столовый», ГОСТом 13907-86 «Баклажаны свежие. Технические условия», ГОСТом 13908 «Перец сладкий свежий. Технические условия». Пробы плодов и ягод анализируют в день отбора или замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °С.

9.1 Экстракция абамектина

9.1.1. Плоды, ягоды. Образец растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 125 куб. см метанола и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 500 куб. см. Осадок на фильтре промывают 80 куб. см метанола. Экстракт и промывную жидкость объединяют в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора, отбирают 1/5 объема этой фазы (эквивалентна 5 г образца) и переносят в грушевидную колбу вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Сок. Образец сока массой 50 г вносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 50 куб. см бидистиллированной воды, 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают. В воронку вносят 30 куб. см гексана, интенсивно встряхивают воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см гексана. Измеряют объем объединенной гексановой фракции, пропущенной через слой сульфата натрия, отбирают 1/10 объема этой фазы (эквивалентна 5 г образца) и переносят в грушевидную колбу вместимостью 50 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре 30 °С и остаток подвергают дериватизации по п. 9.3. Присутствие влаги в остатке недопустимо!

9.2 Очистка экстракта перераспределением в системе

несмешивающихся растворителей

Экстракт, полученный по п. 9.1.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до водного остатка (2 — 3 куб. см). К водному остатку прибавляют 40 куб. см бидистиллированной воды, 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 20 куб. см гексана, интенсивно встряхивают воронку в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия в грушевидную колбу вместимостью 100 куб. см. Экстракцию водной фазы повторяют еще дважды, используя по 10 куб. см гексана. Объединенную гексановую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С и подвергают дериватизации по п. 9.3. Присутствие влаги в остатке недопустимо!

9.3 Дериватизация

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. п. 9.1.2 и 9.2, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Переносят раствор в градуированную пробирку вместимостью 5 куб. см, добавляют 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Смесь охлаждают до 0 — 5 °С, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (п. 7.2), перемешивают и выдерживают 10 мин. при комнатной температуре. Доводят объем раствора до метки ацетонитрилом, перемешивают и аликвоту раствора анализируют на содержание абамектина по п. 9.4.

9.4 Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф фирмы Altex (США), мод. 322, с флуоресцентным детектором фирмы Shimadzu (Япония), мод. RF-530.

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасфер 110-С18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: метанол.

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

    Длина волны: лямбда    возбуждения 365 нм, лямбда    эмиссии 470 нм.
                       max                           max

Чувствительность детектора: 2.

Объем вводимой пробы — 50 куб. мм.

Ориентировочное время выхода абамектина: 7,0 — 7,2 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,5 — 10 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С16.

Ориентировочное время выхода абамектина: 7,5 мин.

Содержание абамектина рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                              Н  х А х V
                               1

Х = ----------, Н х m 0

где:
Х - содержание абамектина в пробе, мг/кг;
Н  - высота пика образца, мм;
 1
Н  - высота пика стандарта, мм;
 0
А - концентрация стандартного раствора абамектина, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемой части образца (для плодов, ягод и сока - 5 г).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

ГНУ ВНИИ фитопатологии.

---