МУК 4.1.2057-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств карбоксина в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 10.04.2006)

10 апреля 2006 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАРБОКСИНА В КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в клубнях картофеля массовой концентрации карбоксина в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.

Карбоксин — действующее вещество препарата Витавакс 200 ФФ.

ВСК (200 + 200 г/л), д.в. карбоксин + тирам, фирма-производитель «Кромптон Юроп Б.В.».

5,6-дигидро-2-метил-1,4-оксатиин-3-карбоксанилид (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

    C  H  NO S.
     12 13  2

Мол. масса 235,3.

Белое кристаллическое вещество. Температура плавления 91,5 — 92,5 °С и 98 — 100 °С (в зависимости от кристаллической структуры). Давление паров при 25 °С: 0,025 мПа. Растворимость в органических растворителях при 25 °С (г/куб. дм): ацетон — 177; дихлорметан — 353; метанол — 88; этилацетат — 93. Растворимость в воде при 25 °С — 199 мг/куб. дм. Вещество устойчиво к гидролизу (25 °С, рН 5 — 9).

Константа диссоциации рКа < 0,5.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс 38200 мг/кг; острая 50 дермальная токсичность (LD ) для кроликов > 4000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LK ) для крыс > 20 мг/куб. дм. 50

Область применения препарата

Карбоксин — фунгицид, используется для протравливания семян пшеницы, ячменя, картофеля против головневых заболеваний, корневых гнилей, плесневения семян.

1. Метрологические характеристики метода (Р = 0,95, n = 24)

Предел обнаружения: 0,05 мг/кг

Диапазон определяемых концентраций: 0,05 — 0,5 мг/кг

Среднее значение извлечения: 94%

Стандартное отклонение: 2,77%

Таблица

Среда	Внесено карбоксина, мг/кг	Обнаружено карбоксина, мг/кг	Полнота извлечения, %
Клубни картофеля	0,05 0,125 0,25 0,5	0,04652 +/- 0,00213 0,11915 +/- 0,00844 0,23289 +/- 0,02005 0,47220 +/- 0,04586	93,04 95,32 93,10 94,44

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после гомогенизирования анализируемого образца измельченного картофеля с флорисилом, последующей экстракции карбоксина системой растворителей дихлорметан — ацетон.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостной  хроматограф  с  ультрафиолетовым            Номер в
детектором с переменной длиной волны (фирмы Waters,     Государственном
США)                                                    реестре средств

                                                    измерений 15311-02

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим ГОСТ 7328 пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0 и 10 куб. см

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью ГОСТ 1770 10, 25, 50, 100, 500 и 1000 куб. см

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Карбоксин, аналитический стандарт с содержанием ГСО 7505-98 действующего вещества 99,7% (ВНИИХСЗР, НПК «Блок-1»)

Ацетон, осч ГОСТ 2306

Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ-6-09-4326-76

Вода деионизованная или перегнанная над KMnO ГОСТ 6709 4

Кислота орто-фосфорная, хч, 85% ГОСТ 6552

Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794

Натрий сернокислый, безводный, хч ГОСТ 4166

Флорисил (60 — 100 меш), адсорбент для хроматографии («Флука», Швейцария)

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Груша резиновая

Колба круглодонная на шлифе вместимостью 250 куб. см ГОСТ 9737

Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм

Насос водоструйный ГОСТ 10696

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный ТУ 25-11-917-74 вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария

Стаканы химические вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336

Стекловата

Стеклянная колонка длиной 30 см, внутренним диаметром 18 мм

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Хроматографическая колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry С18, зернением 5 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.

7.1 Подготовка органических растворителей

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2 Очистка ацетона

7.1 Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над небольшим количеством KMnO и прокаленным 4 карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 400 куб. см ацетонитрила. 600 куб. см деионизованной воды и 1 куб. см 85%-ной орто-фосфорной кислоты перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3 Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4 Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения

7.4.1 Исходный раствор карбоксина для градуировки (концентрация 1 мг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,1 г карбоксина, доводя до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2 Раствор № 1 карбоксина для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного раствора карбоксина с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.4.3. Рабочие растворы № 2 — 5 карбоксина для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помешают по 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой (подготовленной по п. 7.2), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией карбоксина 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 3-х суток.

7.4.4 Раствор карбоксина для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного раствора карбоксина с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетоном до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.5 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации карбоксина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.1. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.6 Подготовка колонки с флорисилом

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см, внутренним диаметром 18 мм уплотняют тампоном из стекловаты, насыпают 2 г безводного сульфата натрия, сверху помещают 1 г флорисила.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ 7001-91.

Отобранные пробы картофеля анализируют в день отбора или хранят при 4 °С в течение 7-ми дней. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре ниже -18 °С.

Перед анализом картофель измельчают (не размораживая) на гомогенизаторе или терке с мелкими ячейками.

9. Выполнение определения

9.1. Образец измельченных клубней картофеля массой 10 г помещают в химический стакан вместимостью 400 куб. см, порциями при перемешивании вносят 15 г флорисила, продолжают перемешивание до достижения сыпучего состояния. Затем пробу переносят (насыпая небольшими порциями через воронку) в колонку, подготовленную по п. 7.5. Заполненная колонка не должна содержать пустот. Колонку смачивают 20 куб. см смеси хлористый метилен — ацетон (9:1, по объему).

Карбоксин элюируют с колонки этой же смесью объемом 130 куб. см со скоростью 2 — 3 капли в секунду непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток в колбе растворяют в 5-ти куб. см подвижной фазы, перемешивают и анализируют содержание карбоксина по п. 9.1.

9.2 Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф «Breeze» с ультрафиолетовым детектором (фирма Waters, США)

Колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Symmetry(R) С18, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода — орто-фосфорная кислота (40:60:0,1, по объему)

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 250 нм

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода карбоксина: 8,9 — 9,2 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2 — 20 нг

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор карбоксина с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой (подготовленной по п. 7.2).

10. Обработка результатов анализа

Содержание карбоксина в пробе рассчитывают по формуле:

                                А х V

Х = -----, m

где:

Х — содержание карбоксина в пробе, мг/кг;

А — концентрация карбоксина, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m — масса анализируемого образца, г.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики

ФГУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана Роспотребнадзора».

---