МУК 4.1.2055-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств флудиоксонила в зерне и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 10.04.2006)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУДИОКСОНИЛА В ЗЕРНЕ И МАСЛЕ СОИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флудиоксонила в зерне и масле сои в диапазоне 0,02 — 0,2 мг/кг.

Флудиоксонил — действующее вещество фунгицида Максим, КС (25 г/л), фирма-производитель Сингента Кроп Протекшн АГ (Швейцария).

4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-пиррол-3-карбонитрил (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

C H F № O . 12 6 2 2 2

Мол. масса: 248,2.

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления: -4

199,8   °С.  Давление  паров  при  25  °С:  3,9  х  10    мПа.  Коэффициент
распределения  н-октанол/вода:  К   log Р = 4,12. Растворимость (г/куб. дм)

                             ow

при 25 °С: ацетон — 190; этанол — 44; н-октанол — 20; толуол — 2,7; гексан

• 0,008; вода — 0,0018.

    В  биологически активных почвах в аэробных условиях флудиоксонил быстро
разлагается или переходит в прочносвязанное состояние: DT   = 10 - 25 дней.

                                                     50

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс и мышей — > 5000 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для крыс — > 2000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — > 2600 мг/куб. м воздуха. 50 Флудиоксонил не оказывает раздражающего действия на слизистые оболочки глаз

и  кожу  кроликов  и  не  обладает  тератогенным,  мутагенным  и онкогенным
эффектами.  Фунгицид  практически  нетоксичен  для  птиц,  рыб, пчел, диких

животных, дождевых червей, дафний и водорослей.

Рекомендуемый норматив для флудиоксонила в зерне и масле сои — 0,02 мг/кг.

Область применения препарата

Флудиоксонил — контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью. Высокоэффективен против снежной плесени, твердой головни, гельминтоспориозной и фузариозной корневых гнилей на зерновых злаках, а также ризоктониоза, склеротиниоза, серой гнили и альтернариоза на винограде, косточковых плодовых, овощных и декоративных культурах.

Зарегистрирован в России под торговым названием Максим, КС (25 г/л) в качестве фунгицида для предпосевного протравливания семян зерновых культур, гороха, а также для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение. В настоящее время проходит регистрационные испытания в качестве протравителя семян сои.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Относительное отклонение, DS, %	Доверительный интервал среднего, %
Зерно	0,02	0,02 — 0,2	82,5	3,8	1,7	+/- 3,5
Масло	0,02	0,02 — 0,2	82,7	3,6	1,6	+/- 3,4

Таблица 2

В МОДЕЛЬНЫХ МАТРИЦАХ (n = 5)

Матрица	Внесено флудиоксонила, мг/кг	Открыто флудиоксонила, %	Доверительный интервал среднего, %
Зерно	0,02	80,0	4,5
	0,04	81,6	3,7
	0,10	83,6	3,5
	0,20	84,7	3,1
Масло	0,02	80,3	+/- 4,1
	0,04	82,0	+/- 3,9
	0,10	83,7	+/- 3,5
	0,20	85,0	+/- 2,1

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль флудиоксонила в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зерна и масла ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Номер Госреестра с переменной длиной волны (фирмы Knauer, Германия)

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим ГОСТ 7328 пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,036 г

Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см

Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Флудиоксонил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,8% (Сингента, Швейцария)

Ацетонитрил, хч                                            ТУ 6-09-3534-87
Вода бидистиллированная                                    ГОСТ 6702
н-Гексан, хч                                               ТУ 6-09-3375

Натрий сернокислый, безводный, хч ГОСТ 4166

Эфир диэтиловый ГОСТ 6265-74

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Co. (США)

Воронка Бюхнера ГОСТ 0147

Воронки делительные вместимостью 100 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Дефлегматор елочный ГОСТ 9737

Колба Бунзена ГОСТ 5614

Колбы плоскодонные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 9737

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 25 и 150 куб. см ГОСТ 9737

Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см ГОСТ 9737

Мельница электрическая лабораторная ТУ 46-22-236

Оксид алюминия нейтральный (Вельм, Германия) 1 степени активности для колоночной хроматографии

Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см

Стекловата

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ТУ 25-11-917 ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария)

Установка для перегонки растворителей

Хроматографическая колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Кромасил 100-С18 (5 мкм)

Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф вместимостью 50 — 100 куб. мм (Hamilton, США)

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1 Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения ее окрашивания в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2 Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

7.1.3 Очистка диэтилового эфира

Растворитель предварительно встряхивают со свежеприготовленным раствором железного купороса, а затем последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

7.2. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию: 10 г оксида алюминия V степени активности в 20 куб. см гексана (оксид алюминия V степени активности по Брокману получают добавлением 15% воды к оксиду алюминия I степени активности). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек., после чего она готова к работе.

7.3. Проверка хроматографического поведения флудиоксонила на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см градуировочного раствора № 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 7.6.2), раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 0,6 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Промывают колонку 50 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Фракционно (по 5 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.4, перемешивают и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 9.4.

7.4. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила, 500 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.5. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.4) при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии.

7.6. Приготовление градуировочных растворов

7.6.1 Исходный раствор флудиоксонила для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 г флудиоксонила, растворяют в 40 — 50 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение 3-х месяцев.

7.6.2 Раствор флудиоксонила № 1 для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов № 2 — 5.

Для приготовления проб зерна и масла с внесением при оценке полноты извлечения флудиоксонила из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор № 1 и ацетоновый раствор флудиоксонила хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца.

7.6.3. Рабочие растворы № 2 — 5 флудиоксонила для градуировки (концентрация 0,05 — 0,5 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора № 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией флудиоксонила 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.7. Установление градуированной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость высоты пика (мм) от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТом 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».

Пробы зерна высушивают до стандартной влажности и хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С. Масло хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С. В некоторых случаях масло получают из зерна сои экстракцией органическими неполярными растворителями (петролейный и диэтиловый эфиры) непосредственно перед проведением анализа.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция флудиоксонила

9.1.1. Зерно. Образец размолотого зерна массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетонитрила и помещают в ультразвуковую ванну на 5 мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 25 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Масло. Образец масла массой 5 г вносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, добавляют 10 куб. см гексана, перемешивают. В воронку вносят 30 куб. см ацетонитрила, интенсивно встряхивают воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют и собирают в химический стакан вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции масляной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см ацетонитрила. Дальнейшую очистку объединенного ацетонитрильного экстракта проводят по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракты, полученные по пп. 9.1.1 и 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 200 куб. см, прибавляют 20 куб. см гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре 40 °С. Остаток в круглодонной колбе растворяют в 20 куб. см смеси ацетонитрил — вода (3:7, по объему) и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 20 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (4:1, по объему), интенсивно встряхивают воронку в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажный фильтр в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водно-ацетонитрильной фазы повторяют еще дважды, используя по 15 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

9.3. Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 0,6 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,4 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 3 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 35 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек., отбрасывают первые 10 куб. см элюата и собирают последующие 25 куб. см в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Остаток в колбе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 7.4, перемешивают и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Knauer, Германия)

Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Кромасил 100-С18 (5 мкм)

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (50:50, по объему)

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода флудиоксонила: 10,5 — 11 мин.

Линейный диапазон детектирования: 1 — 10 нг

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.4

Альтернативная подвижная фаза: Диасорб 130-С16

Ориентировочное время выхода флудиоксонила: 9,6 — 10,3 мин.

10. Обработка результатов анализа

Содержание флудиоксонила рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                              Н  х А х V
                               1

Х = -----------, Н х m 0

где:
Х - содержание флудиоксонила в пробе, мг/кг;
Н  - высота пика образца, мм;
 1
Н  - высота пика стандарта, мм;
 0
А - концентрация стандартного раствора флудиоксонила, мкг/куб. см;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m - масса анализируемой части образца (г) (для зерна и масла - 5 г).

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики

ВНИИ фитопатологии.

---