МУК 4.1.2020-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств пендиметалина в луке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕНДИМЕТАЛИНА В ЛУКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

с момента утверждения

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

1. Вводная часть

Торговое наименование: Кобра КЭ, Эстамп КЭ.

Фирма-производитель: Агротрейд Лтд, ЗАО «Щелково Агрохим».

Действующее вещество: пендиметалин.

Структурная формула (не приводится).

N-(1-этилпропил)-2,6-динитро-3,4-ксилидин (IUPAC).

N-(1-этилпропил)-3,4-диметил-2,6-динитробензиламин (СА).

Брутто-формула: C H № O . 13 19 3 4

Мол. масса: 281,3.

Разлагается при возгонке.

Химически чистый пендиметалин представляет собой оранжево-желтые кристаллы.

Температура плавления 54 — 58 °С. Давление паров 4,0 мПа (25 °С).

Коэффициент распределения в системе н-октанол — вода K lg P = 5,18. ow

Растворимость в воде — 0,3 мг/л (20 °С). Растворимость (г/л) при 26 °С:

ацетон  -  55;  изопропанол  - 77; ксилол - 628; н-гептан - 138; кукурузное
масло   -   148.   Хорошо   растворим  в  бензоле,  толуоле,  хлороформе  и

дихлорметане. Растворим в петролейном эфире и бензине.

    Очень  стабилен  при  хранении  (хранение  при температуре 5 - 130 °С).
Устойчив  к  воздействию  кислот  и щелочей. Медленно разлагается на свету.
DT   в воде - менее 21 дня.

50

Острая пероральная токсичность LD (мг/кг): для крыс — 1050 — 1250. 50 Острая дермальная токсичность LD для кроликов — более 5000 мг/кг. Не 50 ирритант для глаз и кожи. LC (96 часов) для радужной форели — 0,14 мг/л. 50 LD для пчел — более 50 мкг/особь. 50

Группа токсичности по ЕРА — III, ВОЗ — III.

Пендиметалин — селективный гербицид, абсорбируемый корнями и листвой. Используется для контроля большинства однолетних трав и широколиственных сорняков при выращивании большинства сельскохозяйственных растений.

Гигиенические нормативы для пендиметалина в России:

ОДК в почве — 0,15 мг/кг, ПДК в воде водоемов — 0,05 мг/куб. дм (органолептический лимитирующий показатель), ПДК в воздухе рабочей зоны — 0,5 мг/куб. м. МДУ для пендиметалина: соя (семена и масло), чеснок, табак, хмель сухой — 0,1 мг/кг; петрушка — 0,05 мг/кг. ВМДУ для пендиметалина: томаты, морковь, капуста, огурец — 0,05 мг/кг. Для лука гигиенические нормативы в России не установлены.

2. Методика определения пендиметалина в луке методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении пендиметалина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с флорисилом.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0,95
Лук-перо	0,01	0,01 — 0,1	83,6	5,3	4,7
Лук-репка	0,01	0,01 — 0,1	83,7	5,3	4,7

Таблица 2

(n = 6 ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, +/-	Полнота определения, %
1	2	3	4	5
Лук-перо	0,01	0,00841	0,00053	84,1
	0,02	0,01646	0,00111	82,3
	0,05	0,04175	0,0026	83,5
	0,1	0,0846	0,0051	84,6
Среднее				83,6
Лук-репка	0,01	0,00822	0,00057	82,2
	0,02	0,01688	0,00102	84,4
	0,05	0,04215	0,0025	84,3
	0,1	0,0839	0,0052	83,9
Среднее				83,7

2.1.3 Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Пендиметалин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 94,7%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (75:25 по объему).

Флорисил для колоночной хроматографии (0,150 — 0,250 мм) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (75:25 по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный Buchi R-200 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ250 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ100 и КШ500 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

2.4. Отбор проб

Отбор проб лука производится в соответствии с ГОСТ 1723-86 «Лук репчатый свежий, заготовляемый и поставляемый» и ГОСТ 27166-86 «Лук репчатый свежий реализуемый».

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

    Перед   началом  работы  рекомендуется  проверить  чистоту  применяемых
органических  растворителей.  Для  этого  100  мл  растворителя упаривают в
ротационном  вакуумном испарителе при температуре +40 °С до объема 1,0 мл и
хроматографируют.  При  обнаружении  мешающих  определению примесей очистку
растворителей  производят в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан
встряхивают  с  небольшими  порциями  концентрированной  серной  кислоты до
прекращения  окрашивания  свежей  порции  кислоты,  затем  промывают водой,
2%-ным  раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над
гидроксидом  натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия
и  поташом  (на  1 л ацетона 10 г KMnO  и 2 г K CO ). Ацетонитрил сушат над
                                      4        2  3
пентоксидом   фосфора   и   перегоняют;  отогнанный  растворитель  повторно
перегоняют  над  углекислым  калием.  Этилацетат  промывают  равным объемом
5%-ного  раствора  двууглекислого  натрия,  сушат  над хлористым кальцием и

перегоняют.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.

2.5.3 Приготовление растворов

Для получения 50%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для получения 75%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 75:25 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента для колоночной хроматографии в колбе на 1000 мл смешивают 750 мл н-гексана и 250 мл этилацетата.

Приготовление градуировочных растворов

Берут точную навеску пендиметалина (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (исходный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил:вода = 75:25 по объему).

Градуировочные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца.

При изучении полноты определения пендиметалина используют ацетонитрильные растворы вещества. Для внесения в лук-перо и лук-репу растворы с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из градуировочного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Раствор пендиметалина в ацетонитриле с концентрацией 10 мкг/мл для проверки хроматографического поведения пендиметалина на колонке с флорисилом готовят из исходного раствора 0,5 мг/мл последовательным разбавлением ацетонитрилом.

2.5.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация пендиметалина в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пендиметалина в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5 Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г флорисила в 20 мл гексана. Не позволяя высохнуть верхней кромке слоя флорисила, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 10 — 15 мм. Колонку промывают 20 мл элюента для колоночной хроматографии, затем 30 мл гексана со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения пендиметалина на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора пендиметалина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 мл гексана и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл гексана и также вносят на колонку. Промывают колонку 40 мл гексана, которые отбрасывают, затем 50 мл элюента для колоночной хроматографии со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание пендиметалина по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие пендиметалин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание пендиметалина в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания пендиметалина и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Проведение определения

2.6.1 Извлечение пендиметалина из проб лука-репки

Навеску гомогенизированных луковиц массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл. К навеске приливают 100 мл смеси ацетон — вода (3:1 по объему) и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют еще со 100 мл 75%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (45 — 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.2 Извлечение пендиметалина из проб зеленого лука

Навеску гомогенизированных перьев лука массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон — вода (1:1 по объему) и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют со 100 мл 50%-ного водного ацетона. Экстракт упаривают до водного остатка (90 — 95 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.3 Очистка экстрактов

Полученные по п. п. 2.6.1 и 2.6.2 водные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 мл и экстрагируют пендиметалин трижды гексаном порциями по 30 мл (собирают верхний органический слой), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1 — 2 минут. Объединенный гексановый раствор пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4 <*>.

---

<*> В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.3) дает удовлетворительные результаты, дополнительную очистку на колонке с флорисилом можно исключить.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.4 Очистка на колонке с флорисилом

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.5 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя 5 мл порциями гексана в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 40 мл гексана. Элюат отбрасывают. Пендиметалин элюируют 40 мл смеси гексан — этилацетат (75:25 по объему), собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха в вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 432 нм.

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода в соотношении 75:25.

Скорость потока 1 мл/мин.

Время удерживания пендиметалина 8,9 +/- 0,1 мин.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,1 — 2,0 мкг/мл.

2.6.6 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание пендиметалина в образцах растительных материалов (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

                              S  х C х V
                               2

Х = ----------, S х P 1

где:
S  - площадь пика пендиметалина в градуировочном растворе, кв. мм;
 1
S  - площадь пика пендиметалина в анализируемой пробе, кв. мм;
 2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
P - навеска анализируемого образца, г;
C - концентрация градуировочного раствора пендиметалина, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств пендиметалина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор пендиметалина 2 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Требования техники безопасности

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

5. Разработчики

ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург.

---