МУК 4.1.2015-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств беномила по карбендазиму и карбендазима в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 17 октября 2005 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
17 октября 2005 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БЕНОМИЛА ПО КАРБЕНДАЗИМУ И КАРБЕНДАЗИМА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
с момента утверждения
1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
1. Вводная часть
1.1 Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.
Торговое наименование: Фундазол.
Действующее вещество: беномил.
Структурная формула (не приводится).
Метил 1-(бутилкарбомоил)бензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).
Брутто-формула: C H № O . 14 18 4 3
Бесцветные кристаллы. Температура плавления: 140 °С (с разложением).
Давление паров при 25 °С — менее 0,005 мПа.
Коэффициент распределения н-октанол/вода: K lg P = 1,37. ow
Растворимость (г/кг) при 25 °С: ацетон — 18, диметилформамид — 53, этанол — 4, ксилол — 10, хлороформ — 94, гептан — 0,4.
Растворимость (мкг/л) в воде при комнатной температуре: 3,6 (рН 5), 2,9 (рН 7), 1,9 (рН 9).
Гидролиз DT 3,5 часа при рН 5, 1,5 часа при рН 7, менее 1 часа при рН 50
9 (при 25 °С). В некоторых растворителях диссоциирует до карбендазима и бутилизоцианата. В водных растворах, во влажной почве, в присутствии воды
при хранении быстро разлагается.
Стабилен при хранении при температуре ниже 50 °С в отсутствии света и влаги.
В объектах внешней среды беномил быстро превращается в значительно более стабильный карбендазим с DT 19 часов и в воде 2 часа. Такой процесс
50
происходит и в растениях.
Краткая токсикологическая характеристика. Беномил относится к малотоксичным веществам. Острая пероральная токсичность (LD ) Для крыс -
50
более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов — более 50 5000 мг/кг; средняя ингаляционная токсичность (CK /4 часа) для крыс — 50 более 2 мг/л воды. Возможно проявление отрицательных побочных эффектов. Класс токсичности по ЕПА — IV, ВОЗ — III.
Гигиенические нормативы для беномила в России:
ОДК в почве — 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов — 0,5 мг/л; ПДК в воздухе рабочей зоны — 0,1 мг/куб. м; МДУ в продукции (мг/кг): сахарная свекла — 0,1; зерно хлебных злаков — 0,5. В винограде, овощных, плодовых, ягодных культурах, семенах и масле сои содержание остаточных количеств не допускается. Для семян и масла подсолнечника гигиенические нормативы в России не установлены.
Область применения препарата. Беномил — фунгицид системного действия с длительным защитным эффектом, эффективно подавляет развитие широкого круга заболеваний растений, вызываемых грибами из классов аскомицетов, базидомицетов и несовершенных грибов на зерновых и овощных культурах, сахарной свекле, виноградниках, в садах, при обработке семян.
1.2 Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.
Торговое наименование: Колфуго Супер.
Действующее вещество: карбендазим.
Структурная формула (не приводится).
Метилбензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).
Брутто-формула: C H № O . 9 9 3 2
Белые кристаллы. Температура плавления: более 302 - 307 °С (разложение), возгоняется с разложением, начиная с 230 °С. Давление паров
при 20 °С: 0,09 мПа.
Коэффициент распределения н-октанол/вода: K lg P = 1,38 (рН 5), 1,51 ow (рН 7), 1,49 (рН 9) (25 °С).
Растворимость (г/л) при 24 °С: ацетон - 0,3, диметилформамид - 5, этанол - 0,3, этилацетат - 0,135, хлороформ - 0,1, дихлорметан - 0,068, бензол - 0,036, диэтиловый эфир - менее 0,01, циклогексан - менее 0,01,
гексан — 0,0005.
Растворимость в воде при 24 °С: 29 мг/л (рН 4), 8 мг/л (рН 7), 7 мг/л (рН 8).
Стабилен не менее 2 лет при температуре ниже 50 °С, медленно разлагается в щелочных растворах (DT > 124 дня при 22 °С и рН 9),
50
стабилен в кислотах в виде водного раствора соли (DT > 350 дней при рН 5 50
- 7).
Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс - более 15000 мг/кг; острая дермальная
50
токсичность (LD ) для кроликов — более 10000 мг/кг, не ирритант для 50 кроликов; острая ингаляционная токсичность (LC /4 часа) для крыс, кроликов 50
- 10 г/л воды. Нетоксичен для пчел: LD — более 50 мкг/особь. Класс 50 токсичности по ЕПА — IV, ВОЗ — III.
Гигиенические нормативы для карбендазима в России:
ОДК в почве — 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов — 0,1 мг/л; ПДК в воздухе рабочей зоны — 0,1 мг/куб. м; МДУ в продукции (мг/кг): сахарная свекла — 0,1 (ВМДУ); зерно хлебных злаков — 0,2. В землянике, смородине, винограде, яблоках, огурцах — содержание остаточных количеств карбендазима не допускается (ВМДУ). Для семян и масла подсолнечника гигиенические нормативы в России не установлены.
Область применения препарата. Карбендазим — фунгицид широкого спектра действия с защитными и целебными свойствами, применяется для борьбы против септориоза, фузариоза, головневых болезней и др. на зерновых культурах, против различных заболеваний плодово-овощных культур, используется для обработки семян перед посевом.
2. Методика определения остаточных количеств беномила по карбендазиму и карбендазима в семенах и масле подсолнечника методом ВЭЖХ
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода.
Методика основана на определении беномила по карбендазиму и карбендазима методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после извлечения карбендазима из образцов раствором соляной кислоты и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами.
2.1.2 Метрологическая характеристика метода.
Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.
МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА
| Объект анализа | Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24) | Относительное стандартное отклонение, S, % | Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0,95 |
|---|---|---|---|---|---|
| Семена | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 84,4 | 6,55 | 5,74 |
| Масло | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 90,4 | 5,88 | 5,15 |
И ВИНОГРАДНОМ СОКЕ (N = 5 ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)
| Среда | Внесено, мг/кг (мг/л) | Найдено, мг/кг (мг/л) | Стандартное отклонение, S, +/- | Полнота определения, % |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Семена | 0,01 | 0,00852 | -4 6,51 х 10 | 85,2 |
| 0,02 | 0,01692 | -3 1,34 х 10 | 84,6 | |
| 0,05 | 0,04185 | -3 3,41 х 10 | 83,7 | |
| 0,1 | 0,0842 | -3 6,17 х 10 | 84,2 | |
| Среднее | 84,4 | |||
| Масло | 0,01 | 0,00902 | -4 5,51 х 10 | 90,2 |
| 0,02 | 0,01802 | -3 1,33 х 10 | 90,1 | |
| 0,05 | 0,04565 | -3 2,81 х 10 | 91,3 | |
| 0,1 | 0,0898 | -3 5,72 х 10 | 89,8 | |
| Среднее | 90,4 |
2.1.3 Избирательность метода.
Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.
2.2. Реактивы и материалы
Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.
Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.
Бумажные фильтры «синяя лента», ТУ 6.091678-86.
Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-72.
Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.
Карбендазим, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,5%.
Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.
Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.
Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.
Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118-77.
Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.
Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.
н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — 0,1 М ортофосфорная кислота (10:90 по объему).
Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.
2.3. Приборы и посуда
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.
Колонка RES ELUT — РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).
Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-73.
Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.
Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.
рН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.
Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.
Насос водоструйный, МРТУ 42-861-64.
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.
Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.
Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.
Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.
Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.
Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей.
Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.
2.5.2 Кондиционирование колонки.
Перед началом анализа колонку RES ELUT — РН 90А кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.
2.5.3 Приготовление растворов.
Для приготовления 0,1 М раствора ортофосфорной кислоты 10 г 98%-ной кристаллической H PO (или 11,25 г 87%-ного водного раствора) помещают в 3 4 мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и
доводят объем до метки дистиллированной водой.
Для приготовления подвижной фазы смешивают 100 мл ацетонитрила с 900 мл 0,1 М ортофосфорной кислотой в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют.
Для приготовления 0,1 М раствора соляной кислоты 7,75 мл концентрированной HCl вносят в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят до метки деионизированным бидистиллятом.
2.5.4 Приготовление стандартного и градуировочных растворов:
Берут точную навеску карбендазима (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.
Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 1,0 мг/мл методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом. После внесения растворитель удаляют током азота.
2.5.5 Построение градуировочного графика.
Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбендазима в градуировочном растворе (мкг/мл).
2.6. Проведение определения
2.6.1 Определение карбендазима в масле подсолнечника.
Образец подсолнечного масла массой 20 г растворяют в 100 мл н-гексана, количественно переносят в делительную воронку емкостью 500 мл и экстрагируют карбендазим 0,1 М HCl трижды порциями по 100 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2 — 3 мин. и отбирая нижний водный слой. Далее очистку проводят по пункту 2.6.4.
2.6.2 Определение беномила в масле подсолнечника.
При определении беномила в масле подсолнечника по карбендазиму проводят два параллельных анализа. В одном пробоподготовку проводят, как описано в п. 2.6.1, в другом — после предварительного гидролиза беномила.
Гидролиз беномила до карбендазима проводят следующим образом. Образец подсолнечного масла массой 20 г растворяют в 100 мл н-гексана, количественно переносят в делительную воронку емкостью 500 мл и экстрагируют беномил с карбендазимом ацетонитрилом трижды порциями по 100 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2 — 3 мин. и отбирая нижний ацетонитрильный слой. Объединенный ацетонитрильный экстракт промывают дважды в делительной воронке гексаном, порциями по 50 мл (верхний гексановый слой отбрасывают). Ацетонитрильный раствор упаривают до объема 20 — 25 мл на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С, количественно переносят в плоскодонную колбу объемом 500 мл, приливают 300 мл 0,1 М HCl и выдерживают при комнатной температуре в течение суток для полного разложения беномила до карбендазима. Остаток ацетонитрила удаляют на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С, дальнейшую очистку солянокислого экстракта проводят по п. 2.6.5.
2.6.3 Определение карбендазима в семенах подсолнечника.
Навеску измельченных на зерновой мельнице семян подсолнечника массой 20 г помещают в плоскодонную колбу объемом 250 мл, приливают 100 мл 0,1 М HCl и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Экстракцию повторяют еще дважды. Полученный экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр «красная лента». Далее очистку экстракта проводят по п. 2.6.5.
2.6.4 Определение беномила в семенах подсолнечника.
При определении беномила в семенах подсолнечника по карбендазиму проводят два параллельных анализа. В одном пробоподготовку проводят, как описано в п. 2.6.3, в другом — после предварительного гидролиза беномила.
Гидролиз беномила до карбендазима проводят следующим образом: навеску измельченных семян подсолнечника массой 20 г заливают 100 мл 0,1 М HCl и выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Полученный экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр «красная лента». Карбендазим экстрагируют 0,1 М HCl порциями по 100 мл дважды на ультразвуковой ванне. Экстракты фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр «красная лента» и объединяют с первым. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.5.
2.6.5 Очистка экстрактов.
Полученные экстракты промывают в делительной воронке объемом 500 мл дважды гексаном, порциями по 50 мл (верхний гексановый слой отбрасывают) и дважды хлористым метиленом, порциями по 50 мл (нижний дихлорметановый слой отбрасывают), встряхивая каждый раз воронку в течение 3 — 5 минут. К солянокислому раствору добавляют 0,1 М NaOH до рН 10 — 11 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют карбендазим хлористым метиленом трижды порциями по 50 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствор вводят в жидкостный хроматограф.
2.6.6 Условия хроматографирования.
Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 24871), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.
Колонка RES ELUT — РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).
Температура колонки 30 +/- 1 °С.
Предколонка Waters Symmetry С-18 (20 х 3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA), для защиты аналитической колонки.
Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,1 М ортофосфорная кислота в соотношении 10:90 (по объему).
Скорость потока элюента: 1 мл/мин.
Время удерживания карбендазима 9,2 +/- 0,2 мин.
Линейный диапазон детектирования 0,1 — 1,00 мкг/мл.
2.6.7 Обработка результатов анализа.
Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбендазима в пробе семян или масла (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:
S х C х V
2
где:
S - площадь пика карбендазима в стандартном растворе, ед. адс. х с;
1
S - площадь пика карбендазима в анализируемой пробе, ед. адс. х с;
2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
P - навеска анализируемого образца, г (для сока - объем, мл);
C - концентрация стандартного раствора карбендазима, мкг/мл.
Содержание остаточных количеств карбендазима в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбендазима 2 мкг/мл, разбавляют.
Содержание беномила в образцах семян и масла подсолнечника с учетом содержания токсичного метаболита карбендазима (Y, мг/кг) в эквиваленте действующего вещества беномила вычисляют по формуле:
где:
X - количество карбендазима в пробе после проведения предварительной
1
операции гидролиза беномила, мг/кг; K — коэффициент пересчета карбендазима на беномил (K = 1,52).
3. Требования техники безопасности
При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88). При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
4. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».