МУК 4.1.2013-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств тетраметрина в мясе, печени, жире и молоке сельскохозяйственных животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТЕТРАМЕТРИНА В МЯСЕ, ПЕЧЕНИ, ЖИРЕ И МОЛОКЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в мясе, печени, жире и молоке сельскохозяйственных животных массовых концентраций тетраметрина в диапазоне 0,1 — 2,0 мг/кг.

Тетраметрин — действующее вещество ветеринарного препарата НЕОСТОМАЗАН 55 г/л (д.в. тетраметрин 50 г/л + циперметрин 5 г/л), фирма-производитель «Сева Санте Анималь» (Франция).

(1RS,3RS;1RS,3RS)-2,2-диметил-3-(2-метилпроп-1-енил)циклопропанкарбоновой кислоты циклогекс-1-ен-1,2-дикарбоксимидометиловый эфир (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

    C  H  NO .
     19 25  4

Мол. масса: 331,4.

    Бесцветное   кристаллическое  вещество  со  слабым  запахом  пиретрума.
Температура  плавления  -  68  -  70 °С. Давление паров при 25 °С: 2,1 мПа.
Плотность  -  1,1  (20  °С).  Растворимость  в  органических растворителях:
ацетон,   этанол,   метанол,  гексан,  н-октанол  -  более  20  г/куб.  дм.
Растворимость   в   воде  -  1,83  мг/куб.  дм  (при  25  °С).  Коэффициент
распределения в системе октанол/вода: K   log Р - 4,6 (25 °С).

                                   ow

Тетраметрин разрушается в щелочах и сильных кислотах: DT : 16 — 20 50 дней (pH 5), 1 день (pH 7), менее 1 часа (pH 9). Устойчив в кетонах, хлороформе, ксилоле. Стабилен при хранении до 50 °С.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — более 5000 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов > 2000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LK ) для крыс > 2,73 мг/куб. дм (4 часа). 50

Область применения препарата

Тетраметрин — инсектицид класса пиретроидов.

Препарат Неостомазан 55 г/л (д.в. циперметрин 50 г/л + тетраметрин 5 г/л) рекомендуется для борьбы с эктопаразитами (мухами, вшами, блохами, иксодовыми клещами) животных — крупного рогатого скота, овец, лошадей, а также для лечения и профилактики псороптоза, демадекоза и чесотки.

Рекомендуемые МДУ тетраметрина в мышцах, печени, почках, жире, молоке — 0,2 мг/кг.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата, +/-, %
Мясо	0,1	0,1 — 2,0	74,83	2,68	3,7
Печень	0,1	0,1 — 2,0	75,24	2,59	3,6
Жир	0,1	0,1 — 2,0	74,47	1,94	2,7
Молоко	0,1	0,1 — 2,0	76,07	2,92	4,0

ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено тетраметрина, мг/кг	Обнаружено тетраметрина, мг/кг	Полнота извлечения, %
Мясо (говядина)	0,1 0,2 0,5 1,0	0,07281 +/- 0,00915 0,15361 +/- 0,02156 0,29968 +/- 0,01489 0,76884 +/- 0,08825	72,81 74,74 74,92 76,88
Печень	0,1 0,2 0,5 1,0	0,07583 +/- 0,01123 0,15000 +/- 0,00952 0,29867 +/- 0,00806 0,75460 +/- 0,09187	75,83 75,00 74,67 75,46
Жир	0,1 0,2 0,5 1,0	0,07476 +/- 0,00768 0,14803 +/- 0,00928 0,29977 +/- 0,01391 0,74100 +/- 0,06145	74,76 74,02 75,01 74,10
Молоко	0,1 0,2 0,5 1,0	0,07458 +/- 0,01099 0,15433 +/- 0,01813 0,30227 +/- 0,02299 0,79226 +/- 0,07222	74,58 77,16 75,96 76,76

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором (УФ) после экстракции из анализируемой пробы ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с флорисилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы — 50 нг.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым Номер Госреестра 15945-97 детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США)

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения с ГОСТ 7328 наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см

Пробирки градуированные вместимостью 10 куб. см ГОСТ 1770

Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770 вместимостью 25, 50, 100, 200 и 1000 куб. см

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Тетраметрин, аналитический стандарт с содержанием основного вещества 99,2% «Сева Санте Анималь» (Франция)

Ацетонитрил для хроматографии, хч                 ТУ-6-09-4326-76
Вода деионизованная                               ГОСТ 6702
н-Гексан, хч                                      ТУ-6-09-3375
Диэтиловый эфир                                   ОСТ 84-2005-88

Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995

Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794

Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ 4166

Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233

Флорисил (60 — 100 меш), адсорбент для хроматографии («Флука», Швейцария)

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78

Аквадистиллятор ГОСТ 22340

Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)

Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные ТУ 6-09-2678-77 или фильтры из хроматографической бумаги

Ватман 3ММ

Воронки делительные вместимостью 250 и 500 ГОСТ 25336 куб. см

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Груша резиновая

Дефлегматор елочный ГОСТ 9773

Индикаторная бумага универсальная

Колбы плоскодонные вместимостью 100, 250 и ГОСТ 9737 400 куб. см

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью ГОСТ 9737 10, 100 и 250 куб. см

Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Насос водоструйный вакуумный                      ГОСТ 10696
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М            ТУ 25-11-917-74

или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария

Стаканы химические вместимостью 100 и 250 ГОСТ 25336 куб. см

Стекловата

Стеклянная колонка длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая

Кромасил 100 С18, зернением 8 мкм

Центрифуга ТУ 42-219-79

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2 Очистка н-гексана и хлористого метилена

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помешают 680 куб. см ацетонитрила, 320 куб. см деионизированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,5 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.4.1 Исходный раствор тетраметрина (концентрация 500 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,05 г тетраметрина, растворяют в 50 — 70 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2 Рабочие растворы № 1 — 5 тетраметрина (концентрация 2,5 — 50,0 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 500 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией тетраметрина 5; 10; 25 и 50 мкг/куб. см соответственно.

Для приготовления раствора № 1 с концентрацией тетраметрина 2,5 мкг/куб. см в мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 500 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Растворы хранятся в холодильнике не более месяца.

Рабочие растворы используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения тетраметрина из исследуемых образцов.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации тетраметрина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки № 1 — 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.6. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, насыпают 5 г флорисила, медленно наливают в колонку (при открытом кране) 15 — 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонка готова к работе.

7.7. Проверка хроматографического поведения тетраметрина на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см рабочего раствора № 5 с концентрацией тетраметрина 50 мкг/куб. см (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха, остаток растворяют в 5 куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 50 куб. см гексана, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 120 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (8:2, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие тетраметрин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения тетраметрина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».

Обобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при -18 °С.

Непосредственно перед анализом образцы размораживают, пробы органов и тканей массой 200 — 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца мяса печени и жира, а также молока массой 50 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 куб. см.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

К пробе гомогенизированного образца органов животных, а также молока массой 50 г, помещенной в колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 100 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают путем встряхивания в течение 5 мин., выдерживают на ультразвуковой бане 1 мин., затем на встряхивателе 30 мин. и помещают на 12 — 15 часов в холодильник (4 — 6 °С).

Надосадочную жидкость осторожно переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, фильтруя ее через тампон из стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку.

Для более полного разделения фаз эмульсионный слой пробы молока переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 5 мин., затем отделившийся раствор объединяют с первой порцией надосадочной жидкости в круглодонной колбе.

Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С до объема 40 — 50 куб. см (приблизительно в 2 раза), внимательно следя за процессом, не допуская вспенивания и переброса жидкости, затем очищают перераспределением по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Сконцентрированный раствор, полученный по п. 9.1, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, вносят в нее 150 куб. см деионизованной воды, 5 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и 50 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (1:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз нижний слой возвращают в круглодонную колбу, верхний фильтруют через 2-см слой сульфата натрия (помещенный в конусную химическую воронку на бумажном фильтре) в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Водную фазу переносят в делительную воронку и операцию экстракции повторяют новой порцией смеси гексан — диэтиловый эфир (1:1, по объему) объемом 50 куб. см.

Профильтрованный объединенный экстракт упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 20 куб. см ацетонитрила, насыщенного гексаном, и переносят в делительную воронку вместимостью 150 куб. см, добавляют 20 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Разделившиеся фазы переносят в отдельные конические колбы. Нижний ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку, вносят новую порцию гексана объемом 20 куб. см и операцию экстракции повторяют. Затем нижний ацетонитрильный слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, к оставшемуся в воронке гексану приливают ранее отделенный гексановый слой, вносят 10 куб. см ацетонитрила, насыщенного гексаном, встряхивают 1 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой объединяют с первым экстрактом, помещенным в круглодонную колбу, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с флорисилом

Остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5 куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 50 куб. см гексана, элюат отбрасывают.

Тетраметрин элюируют с колонки 100 куб. см смеси гексан — диэтиловый эфир (8:2, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 40 °С, остаток в колбе растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и анализируют содержание тетраметрина по п. 9.4.

9.4. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (680:320, по объему).

Скорость потока элюента: 1,5 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода тетраметрина: 10,3 — 10,5 мин.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор тетраметрина с концентрацией 50 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание тетраметрина в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:

                                А х V

Х = -----, m

где:

А — концентрация тетраметрина, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m — масса анализируемого образца, г.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).

---