МУК 4.1.2000-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Кломазона в зерне, зеленой массе и масле кукурузы методом газожидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 22.07.2005)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 1 октября 2005 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
22 июля 2005 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КЛОМАЗОНА В ЗЕРНЕ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ И МАСЛЕ КУКУРУЗЫ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
1 октября 2005 года
1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана; Всероссийским институтом защиты растений при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 16.06.2005).
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в зерне, зеленой массе и масле кукурузы массовых концентраций кломазона в диапазонах 0,005 — 0,05; 0,01 — 0,10 и 005 — 0,05 мг/кг соответственно.
Кломазон — действующее вещество препарата КЛОЦЕТ, КЭ (720 г/л ацетохлора + 60 г/л кломазона), фирма-производитель «ФМРус».
2-(2-хлорбензил)-4,4-диметил-1,2-оксазолидин-3-он (IUPAC).
Структурная формула (не приводится).
C H ClNO . 12 14 2
Вязкая светло-коричневая жидкость с рыбным запахом. Плотность 1,192 (при 20 °С). Температура плавления 25 °С. Температура кипения 275 °С. Давление паров при 25 °С: 19,2 мПа. Хорошо растворим в ацетоне, ацетонитриле, хлороформе, циклогексане, дихлорметане, метаноле, толуоле,
гептане, диметилформамиде. Растворимость в воде — 1,1 г/куб. дм.
Кломазон стабилен при комнатной температуре не менее 2-х лет, при 50 °С
- не менее 3-х месяцев. В водном растворе, на свету DT — более 30-ти 50 дней.
Краткая токсикологическая характеристика:
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 2077 мг/кг (самцы), 50 1369 мг/кг (самки); острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов > 50 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK ) для крыс > 4,8 мг/куб. 50 дм.
Кломазон — селективный системный гербицид, используемый для борьбы со злаковыми и некоторыми двудольными сорными растениями.
Препарат Клоцет, КЭ (720 г/л ацетохлора + 60 г/л кломазона) рекомендуется к применению на посевах сои, рапса, кукурузы, свеклы и моркови при однократном наземном опрыскивании почвы после посева (перед прикатыванием при недостатке влаги) до всходов культуры.
Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов — 0,02 мг/куб. дм; ОДК в почве — 0,04 мг/кг; ВМДУ в сое (семена, масло) — 0,01 мг/кг.
Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | ||||
| Предел обнаружения, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение S, % | Доверительный интервал среднего результата, +/-, % | |
| Зерно | 0,005 | 0,005 — 0,05 | 89,93 | 4,71 | 5,0 |
| Зеленая масса | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87,76 | 7,47 | 7,9 |
| Масло | 0,005 | 0,005 — 0,05 | 89,61 | 5,85 | 6,2 |
И МАСЛА КУКУРУЗЫ (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)
| Среда | Внесено кломазона, мг/кг | Обнаружено кломазона, мг/кг | Полнота извлечения, % |
|---|---|---|---|
| Зерно | 0,005 0,010 0,025 0,050 | -3 -3 4,5302 х 10 +/- 0,41639 х 10 -3 -3 8,8579 х 10 +/- 1,3425 х 10 -3 0,0228195 +/- 3,3551 х 10 -3 0,044623 +/- 9,1747 х 10 | 90,60 88,58 91,28 89,25 |
| Зеленая масса | 0,01 0,02 0,05 0,1 | -3 -3 9,0520 х 10 +/- 2,2602 х 10 -3 0,183104 +/- 4,6026 х 10 -3 0,0414708 +/- 8,2226 х 10 -3 0,0860146 +/- 16,1498 х 10 | 90,52 91,55 82,94 86,01 |
| Масло | 0,005 0,010 0,025 0,050 | -3 -3 4,7334 х 10 +/- 0,7116 х 10 -3 -3 8,45014 х 10 +/- 2,3479 х 10 -3 0,022760 +/- 3,3551 х 10 -3 0,043914 +/- 2,6688 х 10 | 94,67 84,50 91,04 87,83 |
Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов (ДЭЗ) после экстракции из анализируемой пробы растительного материала смесью ацетон — вода, масла — ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами (образцы зерна и зеленой массы) и на колонке с оксидом алюминия.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы — 0,1 нг.
В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания кукурузы, в том числе ацетохлора.
3.1 Средства измерений
Газовый хроматограф, снабженный детектором электронного захвата с пределом детектирования по Линдану -14 5 х 10 г/с, предназначенный для работы с капиллярной колонкой
Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом ГОСТ 7328 взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью ГОСТ 29227 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см
Пробирки градуированные вместимостью 10 куб. см ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, ГОСТ 1770 50, 100, 200 и 1000 куб. см
Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
3.2 Реактивы
Кломазон с содержанием действующего вещества 99,6% (фирма ФМС)
Алюминий оксид активированный, нейтральный для колоночной хроматографии, 50 — 200 мкм («Акрос Органикс», Бельгия)
Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ-6-09-4326-76
Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над KMnO 4
н-Гексан, хч ТУ-6-09-3375 Изопропиловый спирт (пропанол-2), хч ТУ 6-09-402-75
Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794
Натрий сернокислый безводный, хч ГОСТ 4166
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233
Этиловый эфир уксусной кислоты, ч ГОСТ 22300
Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.
3.3 Вспомогательные устройства, материалы
Азот газообразный из баллона, осч
Аквадистиллятор ГОСТ 22340
Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78 Бумажные фильтры "красная лента" обеззоленные ТУ 6-09-2678-77
Воронки делительные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 25336
Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336
Колбы плоскодонные вместимостью 200 — 250 и 400 куб. см ГОСТ 9737
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 и 250 ГОСТ 9737 куб. см
Колонка капиллярная НР-50 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм
Мешалка магнитная ММ-5 ТУ 25-11.834-80 Микрошприц МШ-1А ТУ 64-1-2850 Насос водоструйный ГОСТ 10696
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный ТУ 25-11-917-74 вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария
Стаканы химические вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336
Стеклянная колонка длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм
Установка для перегонки растворителей
Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.
К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.
При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке.
7.1 Подготовка органических растворителей
7.1.1 Очистка ацетона
Ацетон перегоняют над небольшими количеством KMnO и прокаленным 4 карбонатом калия.
7.1.2 Очистка ацетонитрила
Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.
7.1.3 Очистка этилацетата
Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонке с числом теоретических тарелок не менее 50.
7.1.4 Очистка н-гексана и хлористого метилена
Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.
7.2 Приготовление смеси растворителей для экстракции
В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 800 куб. см ацетона и 200 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают.
7.3 Приготовление градуированных растворов
7.3.1 Исходный раствор кломазона для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г кломазона, растворяют в 50 — 70 куб. см гексана, доводят гексаном до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 4-х месяцев.
Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.
7.3.2 Раствор № 1 кломазона для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.3.1), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают.
Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.
7.3.3. Рабочие растворы № 2 — 5 кломазона для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см)
В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.3.2), доводят до метки гексаном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией кломазона 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.
Растворы хранятся в холодильнике не более 2-х недель.
7.4 Приготовление растворов внесения для оценки полноты
извлечения кломазона из исследуемых образцов
7.4.1 Исходный раствор кломазона (концентрация 100 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г кломазона, растворяют в 50 — 70 куб. см изопропилового спирта, доводят им же до метки, тщательно перемешивают.
7.4.2 Основной раствор кломазона для внесения (концентрация 10 мкг/куб. см)
В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят до метки изопропанолом, тщательно перемешивают.
Раствор хранится в холодильнике не более 2-х недель.
7.5 Установление градуировочной характеристики
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации кломазона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.
В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.
7.6 Подготовка колонки с оксидом алюминия
для очистки экстракта
Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г оксида алюминия в 15 — 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1,5 см. После этого колонка готова к работе.
7.7 Проверка хроматографического поведения кломазона
на колонке с оксидом алюминия
В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора № 4 для градуировки с концентрацией кломазона 5 мкг/куб. см (п. 7.3.3), добавляют 2 куб. см гексана, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Промывают колонку последовательно 50 куб. см гексана, 25 куб. см смеси гексан — этилацетат (95:5 по объему), затем 25 куб. см смеси гексан — этилацетат (90:10 по объему), элюат отбрасывают.
Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан — этилацетат (3:2 по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см гексана, анализируют содержание кломазона по п. 9.4.
Фракции, содержащие кломазон, объединяют и вновь анализируют.
Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Проверку хроматографического поведения кломазона следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.
Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами 13586.3-83 и 10852-86.
Отобранные пробы зерна и зеленой массы кукурузы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 10-ти дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С.
Пробы масла (помещенные в стеклянные флаконы) хранят в холодильнике в течение месяца.
Перед анализом образцы зерна и зеленой массы измельчают.
9.1 Зерно и зеленая масса кукурузы
9.1.1 Экстракция
Образец измельченного зерна массой 40 г или зеленой массы кукурузы массой 20 г помещают в коническую колбу (или химический стакан) вместимостью 400 куб. см, вносят 20 куб. см смеси ацетон — вода (80:20 по объему), гомогенизируют в течение 1 мин., затем добавляют 80 куб. см смеси ацетон — вода (80:20 по объему) и помещают на встряхиватель на 30 мин.
Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон — вода (80:20 по объему). Экстракт и промывку переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.1.2.
9.1.2 Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей
Экстракт, полученный по п. 9.1.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (~ 30 куб. см) при температуре не выше 35 °С, внимательно следя за процессом и не допуская переброса жидкости при вспенивании. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см. Колбу ополаскивают 50 куб. см дистиллированной воды, которую также переносят в делительную воронку. Вносят в делительную воронку 10 г хлористого натрия, перемешивают для растворения соли, добавляют 50 куб. см смеси гексан — хлористый метилен (65:35 по объему), интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см.
Водную фазу вновь переносят в делительную воронку. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 25 куб. см смеси гексан — хлористый метилен (65:35 по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.1.3.
9.1.3 Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия
Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 3-х куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 50 куб. см гексана, 25 куб. см смеси гексан — этилацетат (95:5 по объему) и 25 куб. см смеси гексан — этилацетат (9:1 по объему), элюат отбрасывают. Кломазон элюируют с колонки 30 куб. см смеси гексан — этилацетат (3:2 по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют в 2-х куб. см гексана и анализируют содержание кломазона по п. 9.4.
9.2 Масло
9.2.1 Экстракция
Образец масла массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 200 — 250 куб. см, вносят 50 куб. см ацетонитрила и помещают на магнитную мешалку на 15 мин. После полного разделения фаз верхний ацетонитрильный слой осторожно декантируют в круглодонную колбу вместимостью 150 — 200 куб. см. Экстракцию повторяют еще дважды порциями ацетонитрила по 30 куб. см. Объединенный экстракт, помещенный в круглодонную колбу, упаривают досуха при температуре не выше 35 °С и подвергают очистке по п. 9.2.2.
9.2.2 Очистка экстракта на колонке с оксидом алюминия
Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2.1, растворяют в 3-х куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.5. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку последовательно 50 куб. см гексана и 25 куб. см смеси гексан — этилацетат (95:5 по объему), элюат отбрасывают. Кломазон элюируют с колонки 30 куб. см смеси гексан — этилацетат (3:2 по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек., собирая элюат в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток в колбе растворяют 1 куб. см гексана и анализируют содержание кломазона по п. 9.4.
9.4 Условия хроматографирования
Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:
Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный детектором электронного захвата ионов
Колонка капиллярная НР-50 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм
Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 100 °С, нагрев колонки со скоростью 20 градусов в минуту до температуры 185 °С, далее со скоростью 1 градус в минуту до 195 °С и со скоростью 30 градусов в минуту до 255 °С, выдержка — 3 минуты
Скорость газа 3 (азот) 60 куб. см/мин.
Скорость газа 1 (азот): 30 см/сек., давление 102,46 кПа, поток 1,2867 куб. см/мин., деление потока 1:10,9; сброс 14,02 куб. см/мин.
Хроматографируемый объем: 1 куб. мм
Ориентировочное время выхода кломазона: 13 мин.
Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор кломазона с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют гексаном.
Содержание кломазона в пробе (Х, мг/кг) рассчитывают по формуле:
А х V
А — концентрация кломазона, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
m — масса анализируемого образца, г.
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».