МУК 4.1.1994-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств бродифакума в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 22.07.2005)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БРОДИФАКУМА В ВОДЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана; Всероссийским институтом защиты растений при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 2 от 16.06.2005).

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации бродифакума в воде в диапазоне 0,0005 — 0,01 мг/куб. дм.

Бродифакум — действующее вещество препарата Килрат, Г (0,05 г/кг);

фирма производитель — ООО «Северо-Кавказский Агрохим» (Россия);

3-[3-(4'-Бромбифенил-4-ил)-1,2,3,4-тетрагидро-1-нафтил]-4-гидроксикумарин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

    C  H  BrO .
     31 23   3

Мол. масса 523,4.

Бродифакум — белое порошкообразное вещество (технический продукт — цвет

от  белого  до  желтовато-белого или бежевого). Температура плавления 228 -
232  °С. Давление паров при 20 °С - 0,001 мПа. Растворимость в органических
растворителях  при 20 °С (в мг/куб. дм): ацетон - 20; хлороформ - 3; бензол

                                                           -3

• < 6. Растворимость в воде при 20 °С (в мг/куб. дм): 3,8 х 10 (pH 5,2); 0,24 (pH 7,4); 10 (pH 9,3). Коэффициент <...>.

2. Метод измерений

Метод основан на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Для концентрирования и очистки проб воды использованы патроны для твердофазной экстракции Диапак-С16.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостной  хроматограф  с  ультрафиолетовым               Номер Госреестра
детектором с переменной длиной волны                       15945-97

(фирмы Perkin-Elmer, США)

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения, ГОСТ 7328 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см

Пробирки градуированные с пришлифованной ГОСТ 1770 пробкой вместимостью 5 куб. см

Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770 вместимостью 25, 50, 100, 250 и 1000 куб. см

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Бродифакум технический с содержанием основного вещества не менее 95% (фирмы ООО «Валмбрента Кемикалс»)

Вода деионизованная ГОСТ 6702

Кислота орто-фосфорная, хч, 85% ГОСТ 6552

Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)

Бумажные фильтры «красная лента», обеззоленные или ТУ 6-09-2678-77 фильтры из хроматографической бумаги Ватман 3ММ

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Груша резиновая

Дефлегматор елочный ГОСТ 9773

Колбы плоскодонные вместимостью 100, 250, ГОСТ 9737 400 — 500 куб. см

Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Насос водоструйный вакуумный ГОСТ 10696

Стаканы химические вместимостью 100 и 250 куб. см ГОСТ 25336

Стекловата

Стеклянные палочки

Патроны для твердофазной экстракции Диапак-С16 (АО БиоХимМак, Россия)

Установка для перегонки растворителей

Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая

Кромасил 100 С18 зернением 8 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Шприцы медицинские с разъемом Льюера ГОСТ 22090 вместимостью 5 и 20 куб. см

Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка метанола перегонкой с дефлегматором (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов Диапак-С16.

7.1. Приготовление 0,02 М раствора орто-фосфорной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 1,36 куб. см 85%-ной ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

7.2. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-С16

Концентрирующий патрон промывают с помощью медицинского шприца 2 куб. см метанола со скоростью прохождения растворителя через патрон 1 — 2 капли в сек., затем 5 куб. см деионизованной воды. Патрон готовят непосредственно перед использованием для концентрирования образца.

7.3. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 30 куб. см бидистиллированной или деионизированной воды, 0,5 куб. см орто-фосфорной кислоты, 970 куб. см метанола, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.4. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3) при скорости подачи растворителя 1,0 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.5. Приготовление градуированных растворов

7.5.1. Исходный раствор бродифакума для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,0100 г бродифакума, добавляют 50 — 70 куб. см метанола, помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. для растворения, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3-х месяцев.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2. Раствор № 1 бродифакума для градуировки (концентрация 5 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 5 куб. см исходного градуировочного раствора бродифакума с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют метанолом до метки, перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 5 бродифакума для градуировки (концентрация 0,025 — 0,5 мкг/куб. см).

В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 2,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 5 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.3), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией бродифакума 0,025; 0,05; 0,1 и 0,5 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике в течение 2-х недель.

7.6. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации бродифакума в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений. Устанавливают площадь пика действующего вещества.

Градуировочный график проверяют ежедневно по анализу 2-х растворов для градуировки различной концентрации. Если значения площадей отличаются более чем на 11% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб».

Пробы воды анализируют в день отбора, при необходимости хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °С в течение 3-х недель. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18 °С.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9. Выполнение определения

9.1. Концентрирование и очистка пробы

Образец отфильтрованной воды объемом 200 куб. см, помещенный в химический стакан вместимостью 250 — 300 куб. см, вносят с помощью медицинского шприца на концентрирующий патрон Диапак-С16, подготовленный по п. 7.2, со скоростью пропускания раствора 1 — 2 капли в сек. После завершения концентрирования пробы патрон промывают последовательно тремя порциями по 5 куб. см смеси вода — метанол в следующем объемном соотношении — 9:1, затем 7:3 и 1:1, далее 5 куб. см смеси метанол — 0,02 М орто-фосфорная кислота (1:1 по объему), элюаты отбрасывают. Вещество элюируют с патрона 4 куб. см подвижной фазы, приготовленной по п. 7.3, собирая элюат в градуированную пробирку с пришлифованной пробкой, перемешивают и анализируют на содержание бродифакума по п. 9.2.

9.2. Условия хроматографирования

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С18 зернением 8 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол — вода — орто-фосфорная кислота (97:3:0,05 по объему)

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода бродифакума: 4,8 — 5,0 мин.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор бродифакума с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.1).

10. Обработка результатов анализа

Содержание бродифакума в пробе воды (Х, мг/куб. дм) рассчитывают по формуле:

                                А х V

Х = -----, W

где:

А — концентрация бродифакума, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V — объем раствора, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

---