МУК 4.1.1977-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в яблоках, капусте, ботве и корнеплодах свеклы, семенах кукурузы, семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМИДАКЛОПРИДА В ЯБЛОКАХ, КАПУСТЕ, БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ СВЕКЛЫ, СЕМЕНАХ КУКУРУЗЫ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Вводная часть

Действующее вещество: имидаклоприд.

Структурная формула (не приводится).

1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (IUPAC).

1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (СА).

    Брутто формула: C H  ClN O .
                     9 10   5 2

Мол. масса: 255,7.

Химически чистый имидаклоприд представляет собой бесцветные кристаллы со слабым характерным запахом. Температура плавления 144 °С. Давление паров

      -7                     -7
4 х 10   мРа (20 °С),  9 х 10   мРа (25 °С).  Коэффициент  распределения  в
системе н-октанол - вода K   lg P = 0,57 (21 °С). Растворимость  (г/л)  при

                      ow

20 °С: в воде — 0,61; дихлорметане — 55; изопропаноле — 1,2; толуоле — 0,68; н-гексане < 0,1. Стабилен к гидролизу при pH 5 — 11.

Острая пероральная токсичность LD для крыс — 450 мг/кг. Острая 50 дермальная токсичность LD (24 ч) для крыс — более 5000 мг/кг. Не ирритант 50 для глаз и кожи (кролики). Острая ингаляционная токсичность LC (4 ч) для 50 крыс — более 5323 мг/куб. м, 69 мг/куб. м воздуха (аэрозоль). LC (96 ч) 50 для рыб — 211 (237) мг/л. Группа токсичности по ЕРА и ВОЗ — II.

Мутагенной и тератогенной активности в стандартных тестах не обнаружено.

Область применения

Имидаклоприд — системный инсектицид и инсекто-протравитель группы неоникотиноидов. Эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Может использоваться для обработки как почвы, так и надземных органов растений.

Гигиенические нормативы

    МДУ в зерне кукурузы          - 0,1 мг/кг;
          свекле                  - 0,5 мг/кг;
          капусте                 - 0,1 мг/кг;
          масле подсолнечника     - 0,2 мг/кг;
          семенах подсолнечника   - 0,4 мг/кг.

2. Методика определения имидаклоприда в яблоках, капусте, ботве и корнеплодах свеклы, семенах кукурузы, семенах и масле подсолнечника методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении имидаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблице.

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0,95
Яблоки	0,01	0,01 — 0,1	86,6	6,1	5,6
Капуста	0,01	0,01 — 0,1	82,9	5,7	5,0
Ботва свеклы	0,02	0,02 — 0,2	84,9	6,8	6,0
Корнеплоды свеклы	0,01	0,01 — 0,1	88,0	5,1	4,5
Семена кукурузы	0,01	0,01 — 0,1	83,9	5,9	5,2
Семена подсолнечника	0,01	0,01 — 0,1	84,3	6,2	5,4
Масло подсолнечника	0,01	0,01 — 0,1	84,2	6,9	6,0

2.1.3 Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч                                         ТУ 6-09-3513-86
Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или хч              ТУ 6-09-3534-87
Бумажные фильтры "красная лента"                    ТУ 6.091678-86

Вода бидистиллированная, деионизированная ГОСТ 6709-72

Дихлорметан, хч ТУ 6-09-3716-80

Имидаклоприд, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Sigma-Aldrich)

Калий углекислый, хч ГОСТ 4221-76

Калия перманганат ГОСТ 20490-75

Кальция хлорид, хч ГОСТ 4161-77

Кислота серная, хч ГОСТ 4204-77

Натрий двууглекислый ГОСТ 83-79

Натрий серно-кислый безводный, ч,

свежепрокаленный ГОСТ 4166-76

Натрия гидроксид, хч ГОСТ 4328-77

н-Гексан, хч, свежеперегнанный ТУ 2631-003-05807999-98

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (20:80, по объему)

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 — 0,063 mm) (Merck, Германия)

Стекловата

Фосфора пентоксид, ч МРТУ 6-09-5759-69

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (50:50, по объему)

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (10:90, по объему)

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters)

Предколонка Waters Symmetry С-18

Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные ГОСТ 24104-80Е

Гомогенизатор                                               МРТУ 42-1505-63
Установка ультразвуковая "Серьга"                           ТУ 3.836.008
Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ                          ТУ 1-01-0593-79
Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М или аналогичный      ТУ 25-11-917-74

Бидистиллятор

pH-метр универсальный ЭВ-74 ГОСТ 22261-76

Насос водоструйный                                          МРТУ 42 861-64
Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС                 ГОСТ 10384-72
Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС          ГОСТ 10384-72

Воронки лабораторные В-75-110 ГОСТ 25336-82

Воронки делительные ВД-3-500 ГОСТ 8613-75

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см ГОСТ 20292-74

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с действующим ГОСТом. Пробы семян для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Пробы ботвы и корнеплодов свеклы, капусты и яблок хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца. Перед анализом их гомогенизируют.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

    Перед  началом  работы  рекомендуется  проверить  чистоту   применяемых
органических  растворителей. Для  этого  100 мл  растворителя  упаривают  в
ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема  1,0 мл  и
хроматографируют. При обнаружении  мешающих  определению  примесей  очистку
растворителей производят в соответствии  с общепринятыми методиками. Гексан
и хлористый метилен  встряхивают  с  небольшими  порциями концентрированной
серной кислоты  до прекращения  окрашивания  свежей  порции  кислоты, затем

промывают водой, 2%-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего

его сушат над  гидроксидом  натрия  и  перегоняют.  Ацетон  перегоняют  над
перманганатом  калия  и  поташом  (на 1 л ацетона 10 г KMnO  и  2 г K CO ).
                                                           4         2  3
Ацетонитрил  сушат  над  пентоксидом  фосфора  и   перегоняют;   отогнанный
растворитель  повторно   перегоняют  над   углекислым   калием.  Этилацетат
промывают  равным  объемом  5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над

хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления 1М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для приготовления 0,02М раствора NaOH 20 мл 1М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 20:80 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента № 1 в колбе на 1000 мл смешивают 500 мл н-гексана и 500 мл этилацетата. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1000 мл смешивают 100 мл н-гексана и 900 мл этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл. Берут точную навеску имидаклоприда (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил — вода (20:80, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При изучении полноты определения имидаклоприда используют ацетонитрильные растворы вещества. Для внесения в капусту, яблоки, ботву и корнеплоды свеклы, семена кукурузы и подсолнечника растворы с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом. Растворы для внесения в масло готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация имидаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 мл смеси гексан — этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 мл элюента № 2 и 30 мл элюента № 1 со скоростью 1 — 2 капли в с, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 мл элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента № 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 120 мл элюента № 1, которые отбрасывают, затем 100 мл элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.6.7.

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.7. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания имидаклоприда и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Извлечение имидаклоприда из проб яблок, капусты, ботвы и корнеплодов свеклы

Навеску гомогенизированных яблок, капусты или корнеплодов свеклы массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон — вода (3:1, по объему) и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 мл 75%-го водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (45 — 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.2. Извлечение имидаклоприда из проб ботвы свеклы

Навеску гомогенизированной ботвы свеклы массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон — вода (1:1, по объему) и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 мл 50%-го водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 10 г ботвы. Экстракт упаривают до водного остатка (40 — 45 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.3. Извлечение имидаклоприда из проб семян кукурузы и подсолнечника

Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян кукурузы и подсолнечника (20 г) помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 75 мл ацетонитрила и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 75 мл ацетонитрила. Объединенные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 мл и промывают трижды гексаном порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 — 3 мин. и отбрасывая верхний гексановый слой. Экстракт упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 50 мл ацетона, выдерживая в течение 5 мин. на ультразвуковой ванне. К экстракту добавляют 50 мл дистиллированной воды. Экстракт упаривают до водного остатка (45 — 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой, фильтруют через фильтр «красная лента». Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.4. Извлечение имидаклоприда из проб масла подсолнечника

Навеску масла массой 20 г растворяют в 100 мл гексана, помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и экстрагируют имидаклоприд трижды дистиллированной водой порциями по 30 мл, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 — 3 мин. и собирая нижний водный слой. Объем экстракта доводят до 100 мл дистиллированной водой, фильтруют через фильтр «красная лента». Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.5. Очистка экстрактов

Полученные по п. п. 2.6.1 - 2.6.4 водные экстракты промывают в делительной воронке емкостью 250 мл трижды гексаном порциями по 30 мл (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1 — 2 мин. Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 — 3 мин. и собирая нижний органический слой <*>. Объединенный метиленхлоридный раствор промывают в делительной воронке дважды 0,02М раствором NaOH порциями по 30 мл, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл хлористого метилена. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.6 <**>.

---

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном — небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта, а на стадии переэкстракции — насыщенный раствор хлорида натрия (15 — 20 мл).

<**> В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.4) дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.6. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.5 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан — этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 120 мл элюента № 1. Элюат отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 70 мл элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 мл. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.7. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 268 нм.

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода в соотношении 20:80. Скорость потока 1 мл/мин. Время удерживания имидаклоприда 11,9 +/- 0,2 мин.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,1 — 2,0 мкг/мл.

2.6.8. Обработка результатов анализа

    Количественное  определение  проводят  методом  абсолютной градуировки,
содержание  имидаклоприда  в образцах  растительных  материалов  (Х, мг/кг)

вычисляют по формуле:

                              S  х С х V
                               2

X = ----------, S х Р х R 1

где:
S  - площадь пика имидаклоприда в стандартном растворе, кв. мм;
 1
S  - площадь пика имидаклоприда в анализируемой пробе, кв. мм;
 2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
Р - навеска анализируемого образца, г;
С - концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/мл;
R - коэффициент извлечения имидаклоприда.

Содержание остаточных количеств имидаклоприда в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор имидаклоприда 2 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе в химических лабораториях, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и других используемых приборов.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

5. Разработчики

Цибульская И.А., Юзихин О.С., Привезенцев В.В. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).

---