МУК 4.1.1973-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств эпоксиконазола в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЭПОКСИКОНАЗОЛА В БОТВЕ И КОРНЕПЛОДАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Вводная часть

Действующее вещество: эпоксиконазол.

(2RS,3SR)-1-[3-(2-хлорфенил)-2,3-эпокси-2-(4-фторфенил)пропил]-1H-1,2,4-триазол(ИЮПАК).

цис-1-[[3-(2-хлорфенил)-2-(4-фторфенил)оксиранил]метил]-1H-1,2,4-триазол(С.А.).

Структурная формула (не приводится).

    Эмпирическая формула: C  H  ClFN O.
                           17 13    3

Молекулярная масса: 329,8.

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления: 136,2 °C.

Давление паров при 20 °C: менее 0,01 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 3,44 (pH 7). ow

Растворимость (г/л) при 20 °C: ацетон — 144, дихлорметан — 291, н-гептан — 0,4; вода — 6,6 мг/л.

Вещество стабильно при нормальных условиях хранения, не гидролизуется в водном растворе при различных значениях температуры и pH.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — более 5000 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для крыс — более 2000 мг/кг, острая 50 ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — более 5,3 мг/л воздуха. 50

Эпоксиконазол  не  оказывает  раздражающего  действия  на  кожу и слизистую
оболочку глаз кролика. LC   для рыб - 2,2 - 6,8 мг/кг (96 ч).

                     50

Эпоксиконазол нетоксичен для пчел, дождевых червей, птиц, дафний и водорослей.

Гигиенические нормативы

МДУ в сахарной свекле 0,1 мг/кг.

Область применения препарата

Эпоксиконазол — системный фунгицид широкого спектра действия из класса триазолов. Высокоэффективен против возбудителей ржавчины, мучнистой росы, пятнистостей листьев и колоса зерновых культур.

2. Методика определения остаточных количеств эпоксиконазола в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на газохроматографическом определении эпоксиконазола на неподвижной фазе SE-30 с использованием электронозахватного детектора (ЭЗД) после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания сахарной свеклы.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

2.2. Реактивы, растворы и материалы

Эпоксиконазол с содержанием д.в. 99,8% (БАСФ, Германия)

Ацетон ГОСТ 2603-79

Вода дистиллированная или деионизованная                    ГОСТ 7602-72
н-Гексан, ч                                                 ТУ 6-09-3375-78

Калия перманганат ГОСТ 20490-75

Кальция хлорид, хч ГОСТ 4161-77

Калий углекислый, хч ГОСТ 4221-76

Кислота серная, хч ГОСТ 4204-77

Натрий двууглекислый ГОСТ 83-79

Натрия гидроксид, хч ГОСТ 4328-77

Натрия сульфат безводный, хч ГОСТ 4166-76

Натрия хлорид, хч ГОСТ 4233-77

Этилацетат ГОСТ 22300-76

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — ацетон (8:2, по объему)

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан — ацетон (6:4, по объему)

Азот газообразный, осч ГОСТ 9293-74

Стекловата

Целит 535 (2 — 15 мкм) (Серва, Германия)

Фильтры бумажные, синяя лента ТУ 6-09-1678.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с ЭЗД с пределом -15 детектирования по Линдану не выше 8,2 х 10 г/куб. см или аналогичный

Колонка хроматографическая 1500 х 3 мм, неподвижная фаза 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 — 0,15 мм)

Колонка хроматографическая 1500 х 3 мм, неподвижная фаза 3% SE-30 на Хромосорбе W/HP (0,12 — 0,15 мм)

Колонка капиллярная для ГЖХ ZB-1, длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex, США или аналогичная

Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф                           ТУ 64-1-2850
Весы аналитические типа ВЛР-200                             ГОСТ 19401-74
Гомогенизатор или аналогичный                               МРТУ 42-1505-63
Ротационный испаритель, тип ИР-1М                           ТУ 25-11-917-76

Прибор для перегонки при атмосферном давлении

Вакуумный водоструйный насос                                ГОСТ 10696-75
Воронка Бюхнера                                             ГОСТ 0147-73
Колба Бунзена                                               ГОСТ 5614-75

Воронки делительные вместимостью 100 и 500 мл ГОСТ 25336-82

Колбы конические с притертыми пробками ГОСТ 25336-82 вместимостью 250 мл

Колбы мерные вместимостью 50 и 100 мл ГОСТ 1770-74

Колбы грушевидные вместимостью 50, 100, 250 мл ГОСТ 25336-82

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100 и 250 мл ГОСТ 1770-74

Пробирки градуированные с притертыми пробками ГОСТ 10515-75 вместимостью 5 и 10 мл

Пипетки мерные вместимостью 1, 2 и 5 мл ГОСТ 20292-74Е

Воронки стеклянные ГОСТ 9737-70.

2.4. Отбор проб

Отбор образцов проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы ботвы и корнеплодов хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более двух дней; при длительном хранении (не более трех месяцев) пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C. Перед анализом ботву и корнеплоды измельчают и отбирают усредненную пробу.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворитель последовательно промывают водой, 2,5%-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона

10 г KMnO  и 2 г K CO ).

         4        2  3

Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 150 °C в течение 3 ч.

2.5.2 Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% SE-30 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 270 °C в течение 8 — 10 ч.

2.5.3 Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор эпоксиконазола с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,8% д.в., в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора эпоксиконазола соответствующим последовательным разведением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более недели.

2.5.4 Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора эпоксиконазола с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ х с от концентрации эпоксиконазола в растворе в мкг/мл.

2.5.5 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 10 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 мл смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) и 20 мл гексана со скоростью 1 — 2 капли в с, после чего она готова к работе.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения эпоксиконазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 1 мл стандартного раствора эпоксиконазола с концентрацией 1 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл смеси гексан — ацетон (8:2) и затем 40 мл смеси гексан — ацетон (6:4) со скоростью 1 — 2 капли в с. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание эпоксиконазола по п. 2.7.1.

Фракции, содержащие эпоксиконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл этилацетата и вновь анализируют по п. 2.7.1. Рассчитывают содержание эпоксиконазола в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания эпоксиконазола может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1 Экстракция эпоксиконазола и очистка экстракта

К навеске (25 г) измельченной ботвы или корнеплодов добавляют 100 мл смеси ацетон — вода (80:20, по объему), гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон — вода (80:20). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 32 мл), эквивалентную 5 г растительного материала, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °C. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 15 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 30 мл гексана и содержимое встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев отделяют гексановую фазу и собирают ее в колбу емкостью 100 мл. Оставшуюся водную фазу обрабатывают гексаном еще два раза (по 30 мл). Объединенный гексановый экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия в грушевидную колбу емкостью 200 мл и затем упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.2.

2.6.2 Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстракта растительного материала из п. 2.6.1, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан — ацетон (8:2) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 40 мл элюента № 1, элюат отбрасывают. Эпоксиконазол элюируют 30 мл элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Полученный раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Сухой остаток растворяют в 5 мл этилацетата и анализируют на содержание эпоксиконазола по п. 2.7.1.

2.7. Условия хроматографирования

2.7.1 Метод ГЖХ с насадочными колонками

    Газовый  хроматограф  "Кристалл  2000М" с электронозахватным детектором
   63                                                        -15
(Ni  ) с пределом  детектирования по Линдану не выше 8,2 х 10    г/куб. см.

Колонка хроматографическая стеклянная, 1500 х 3 мм; неподвижная фаза — 3% SE-30 на Хромосорбе W/HP (0,12 — 0,15 мм).

Температура детектора — 320 °C, испарителя — 270 °C, термостата колонки — 230 °C.

Скорость потока газа-носителя (азота) — 40 мл/мин.

Объем вводимой пробы — 2 мкл.

Время удерживания эпоксиконазола — 2 мин. 10 с.

Предел детектирования — 0,1 нг.

Линейный диапазон детектирования — 0,1 — 1,0 нг.

Альтернативная фаза: 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 — 0,15 мм), хроматографическая колонка 1500 х 3 мм; температура детектора — 320 °С, инжектора — 270 °C, термостата колонки — 255 °C.

Время удерживания эпоксиконазола — 3 мин. 25 с.

Каждую анализируемую пробу вводят три раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.

2.7.2 Метод ГЖХ с капиллярными колонками

    Газовый  хроматограф  "Кристалл  2000М" с электронозахватным детектором
   63                                                        -15
(Ni  ) с пределом  детектирования по Линдану не выше 8,2 х 10    г/куб. см.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-1, 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм (SE-30).

Температура термостата испарителя — 270 °C, детектора — 320 °C, термостата колонки по следующей программе: 170 °C — 2 мин.; 25 °C/мин. до 250 °C; выдержка — 10 мин.

Газовый режим: газ-носитель — азот, общий расход — 22,5 мл/мин.; газ для поддува в детектор — азот, расход — 19,3 мл/мин.

Деление потока: 1:6.

Абсолютное время удерживания эпоксиконазола: 9 мин. 10 с.

Объем вводимой пробы — 1 мкл.

Линейный диапазон детектирования: 0,025 — 0,5 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,2 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание эпоксиконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                              Н  х А х V
                               1

х = ----------, Н х m 0

где:
Х - содержание эпоксиконазола в пробе, мг/кг;
Н  - площадь пика анализируемой пробы, мВ х с;
 1
Н  - площадь пика стандартного раствора, мВ х с;
 0
А - концентрация стандартного раствора эпоксиконазола, мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
m - масса анализируемой части образца, г (для ботвы и корнеплодов - 5 г).

3. Требования техники безопасности

Соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с легко воспламеняющимися жидкостями, токсичными веществами, электронагревательными приборами, сосудами, работающими под вакуумом.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. Разработчики

Назарова Т.А., Микитюк О.Д., Л.В. Дубовая, А.М. Макеев, ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел.: 592-92-20.