--- title: "\"МУК 4.1.1966-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии. Методические указания\"" number: "МУК 4.1.1966-05" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-1-1966-05" --- ## "МУК 4.1.1966-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии. Методические указания" # "МУК 4.1.1966-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 21.04.2005) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299). > Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32). > Документ [введен](#p100002) в действие с 1 июля 2005 года.
Утверждаю
Руководитель
Федеральной службы
по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
21 апреля 2005 года #### 4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ **ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРОТИОКОНАЗОЛА** **ПО ЕГО ОСНОВНОМУ МЕТАБОЛИТУ ПРОТИОКОНАЗОЛ-ДЕСТИО** **В ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР** **МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.1966-05**
Дата введения
1 июля 2005 года ## 1. Вводная часть Действующее вещество: протиоконазол (JAU 6476). 2-[(2RS)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2H-1,2,4-триазол-3(4H)-тион (ИЮПАК). 2-[2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-1,2-дигидро-3H-1,2,4-триазол-3-тион (С.А.). Структурная формула (не приводится). Эмпирическая формула: C H Cl N OS. 14 15 2 3 Молекулярная масса: 344,3. Бесцветное или светло-бежевое твердое вещество без запаха. Температура плавления: 139,1 - 144,5 °C. -7 Давление паров при 20 °C: << 4 х 10 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 4,16 (pH 4), 3,82 ow (pH 7) и 2,0 (pH 9). Растворимость (г/л) при 20 °C: ацетон - более 250, этилацетат - более 250, дихлорметан - 88, ацетонитрил - 69; растворимость в воде - 0,005 (pH 4), 0,3 (pH 8) и 2,0 (pH 9). Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT = 50 120 дней) и щелочной (DT => 1 года) средах. 50 В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 ч. Краткая токсикологическая характеристика Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс - более 6200 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для крыс - более 2000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LC ) для крыс - более 4990 мг/куб. м воздуха. 50 Протиоконазол не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз, не обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием. LC для рыб - 1,83 мг/л (96 ч). 50 Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов. Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665). Альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1H-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.). Эмпирическая формула: C H Cl N O. 14 15 2 3 Молекулярная масса: 312,2. Бесцветный порошок без запаха. Температура плавления: 108,5 °C. -7 Давление паров при 20 °C: 2,7 х 10 Па. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 3,04. ow Растворимость (г/л) при 20 °C: гексан - 3, толуол - 84, ацетон - 100, ацетонитрил - 43, дихлорметан - более 200, вода - 0,051. Метаболит стабилен в кислой и щелочной средах (DT => 500 ч). 50 Другие физико-химические и токсикологические характеристики протиоконазол-дестио отсутствуют. Гигиенические нормативы для протиоконазола и протиоконазол-дестио в России не установлены. Область применения препарата Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке вегетирующих растений оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью. Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения - протиоконазол-дестио (альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1H-1,2,4-1-этанол) (SXX 0665). В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зерне и соломе зерновых колосовых культур по протиоконазол-дестио. ## 2. Методика определения остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии ### 2.1. Основные положения ##### 2.1.1 Принцип метода Методика основана на газохроматографическом определении протиоконазол-дестио (SXX 0665) с ЭЗД на неподвижной фазе OV-17 после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки. ##### 2.1.2 Избирательность метода В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых колосовых культур. ##### 2.1.3 Метрологическая характеристика метода Таблица **МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МЕТОДА**
АнализируемыйМетрологические параметры, P = 0,95, n = 20
объектпредел обнаружения, мг/кгдиапазон определяемых концентраций, мг/кгсреднее значение определения, %стандартное отклонение S, %относительное отклонение DS, %доверительный интервал среднего, %
Зерно0,020,02 - 0,288,65,32,4+/- 4,9
Солома0,10,1 - 1,083,63,61,6+/- 3,4
### 2.2. Реактивы, растворы, материалы Протиоконазол-дестио с содержанием д.в. 98,5% (Байер, Германия) Ацетон, ч.д.а. ГОСТ 2603-79 Вода бидистиллированная ГОСТ 7602-72 Гексан, ч. ТУ 6-09-3375-78 Дихлорметан [ГОСТ 12794-80](https://bukva.ai/docs/standart-gost-12794-80) Калия перманганат ГОСТ 20490-75 Кальция хлорид, х.ч. ГОСТ 4161-77 Калий углекислый, х.ч. [ГОСТ 4221-76](https://bukva.ai/docs/standart-gost-4221-76) Кислота серная, х.ч. ГОСТ 4204-77 Натрия гидроксид, х.ч. ГОСТ 4328-77 Натрий двууглекислый ГОСТ 83-79 Натрия сульфат безводный, х.ч. [ГОСТ 4166-76](https://bukva.ai/docs/gost-4166-76) Этилацетат [ГОСТ 22300-76](https://bukva.ai/docs/gost-22300-76) Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (85:15, по объему) Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (70:30, по объему) Элюент N 1 для Диапак-диола: смесь гексан-дихлорметан (1:1, по объему) Алюминия оксид 90 (0,063 - 0,2 мм), нейтральный для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия) I степени активности по Брокману Концентрирующий патрон Диапак-диол (ЗАО БиоХимМак СТ, Москва, Ленинские горы, МГУ)
Азот газообразный, ос.ч. ГОСТ 0203-74
Стекловата Фильтры бумажные "синяя лента" ТУ 6-09-1678 ### 2.3. Приборы, аппаратура, посуда Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с ЭЗД с пределом детектирования по Линдану не выше -14 3,18 х 10 г/с или аналогичный Колонка хроматографическая, набивная, стеклянная, 1000 х 3 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм) Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф ТУ 64-1-2850 Аппарат для встряхивания АВУ ТУ 64-1-1081-83 Весы аналитические типа ВЛР-200 ГОСТ 19401-74 Водоструйный насос ГОСТ 10696-75 Колонка для адсорбционной хроматографии Мельница электрическая, лабораторная ТУ 46-22-236-79 или аналогичная Ротационный испаритель, тип ИР-1М ТУ 25-11-917-76 Баня ультразвуковая, модель D 50 Branson Instr.Co, США Баня водяная ТУ 46-22-603-75 Воронка Бюхнера ГОСТ 0147-73 Воронки делительные вместимостью 100 мл ГОСТ 25336-82 Воронки для фильтрования стеклянные ГОСТ 8613-75 Колба Бунзена ГОСТ 5614-75 Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100, 250 мл ГОСТ 9737-70 Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл ГОСТ 25336-82 Колбы мерные вместимостью 25, 50 и 100 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Колбы грушевидные вместимостью 50 и 100 мл ГОСТ 25336-82 Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл [ГОСТ 20292-74Е](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20292-74) Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 мл ГОСТ 10515-75 Цилиндры мерные вместимостью 25, 50 и 100 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) ### 2.4. Отбор проб Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными [правилами](https://bukva.ai/docs/2051-79) отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79). Отобранные пробы зерна и соломы досушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре или в холодной комнате при температуре 4 °C. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице. ### 2.5. Подготовка к определению ##### 2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO и 2 г K CO ). 4 2 3 Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют. Оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 4,6% воды к навеске оксида алюминия фирмы Мерк (Германия) I степени активности. ##### 2.5.2 Подготовка и кондиционирование колонки Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °C в течение 8 - 10 ч. ##### 2.5.3 Приготовление стандартных растворов Основной стандартный раствор протиоконазол-дестио с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0102 г вещества, содержащего 98,5% д.в., в этилацетате в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °C не более месяца. Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита соответствующим последовательным разведением этилацетатом. При изучении полноты открывания протиоконазол-дестио в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества. ##### 2.5.4 Построение калибровочного графика Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ x с от концентрации протиоконазол-дестио в растворе в мкг/мл. ##### 2.5.5 Подготовка колонки с оксидом алюминия
и концентрирующего патрона Диапак-диол
для очистки экстракта В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г оксида алюминия III степени активности по Брокману в 20 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе. Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл смеси дихлорметан-ацетон (1:1, по объему), а затем 8 мл смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 мл/мин. ##### 2.5.6 Проверка хроматографического поведения протиоконазол-дестио на колонке с оксидом алюминия В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и наносят на подготовленную хроматографическую колонку [(п. 2.5.5)](#p100117). Промывают колонку 30 мл элюента N 1 (смесь гексан-этилацетат, 85:15) и затем 30 мл элюента N 2 (смесь гексан-этилацетат, 70:30) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание протиоконазол-дестио по [п. 2.7](#p100133). Фракции, содержащие протиоконазол-дестио, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл этилацетата и вновь анализируют по [п. 2.7](#p100133). Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента. Примечание: Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей. ### 2.6. Описание определения ##### 2.6.1 Экстракция протиоконазол-дестио К навеске размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70%-го водного ацетона и суспензию, перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл 70%-ного водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (соответственно около 35 и 25 мл), эквивалентную 5 г зерна или 1 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по [пп. 2.6.2](#p100127), [2.6.3](#p100129) и [2.6.4](#p100131). ##### 2.6.2 Очистка экстракта Отобранные аликвоты растительного экстракта (из [п. 2.6.1](#p100125)) упаривают до водной фазы (объем около 5 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °C. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной воды, 30 мл дихлорметана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают дихлорметаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. ##### 2.6.3 Очистка на колонке с оксидом алюминия К остатку в колбе, полученному при упаривании очищенных по [п. 2.6.2](#p100127) экстрактов растительного материала, приливают 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты. Раствор переносят в подготовленную хроматографическую колонку [(п. 2.5.5)](#p100117). Промывают колонку 25 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 25 мл смеси гексан-этилацетат (70:30, по объему) в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °C. Сухой остаток экстракта зерна растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по [п. 2.7](#p100133). Экстракт соломы подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак-диол. ##### 2.6.4 Очистка на концентрирующем патроне Диапак-диол Сухой остаток экстракта соломы из [п. 2.6.3](#p100129) переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол [(п. 2.5.5)](#p100117). Патрон промывают 5 мл смеси гексан-дихлорметан (1:1, по объему) со скоростью 5 мл/мин., которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 12 мл дихлорметана. Элюат упаривают досуха в грушевидной колбе емкостью 50 мл на роторном испарителе при температуре 30 °C. Для удаления следовых количеств дихлорметана в колбу приливают 5 мл гексана и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по [п. 2.7](#p100133). ### 2.7. Условия хроматографирования Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с электронозахватным детектором 63 -14 (Ni ) с пределом детектирования по Линдану не выше 3,18 х 10 г/с. Колонка хроматографическая, стеклянная, 1000 х 3 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм). Температура детектора - 320 °C, испарителя - 270 °C, термостата колонки - 230 °C. Скорость потока газоносителя (азот) - 30 мл/мин.; поддув - 25 мл/мин. Объем вводимой пробы - 2 мкл.
Время удерживания протиоконазол-дестио - 2 мин. 28 с.
Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1 нг. Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом. ### 2.8. Обработка результатов анализа Содержание протиоконазол-дестио рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле: H x A x V 1 X = ----------, H x m 0 где: X - содержание протиоконазол-дестио в пробе, мг/кг; H - площадь пика образца, мВ x с; 1 H - площадь пика стандарта, мВ x с; 0
A - концентрация стандартного раствора протиоконазол-дестио, мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл; m - масса анализируемой части образца, г (для зерна - 5 г, для соломы - 1 г). При установлении уровня протиоконазола полученное значение содержания протиоконазола-дестио (X) умножают на 1,1. ## 3. Требования техники безопасности Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами. ## 4. Контроль погрешности измерений Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с [ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-4-2002) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".
Разработчики: Дубовая Л.В., Макеев А.М.
ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.
---