МУК 4.1.1966-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

21 апреля 2005 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРОТИОКОНАЗОЛА ПО ЕГО ОСНОВНОМУ МЕТАБОЛИТУ ПРОТИОКОНАЗОЛ-ДЕСТИО В ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1 июля 2005 года

1. Вводная часть

Действующее вещество: протиоконазол (JAU 6476).

2-[(2RS)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2H-1,2,4-триазол-3(4H)-тион (ИЮПАК).

2-[2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-1,2-дигидро-3H-1,2,4-триазол-3-тион (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

    Эмпирическая формула: C  H  Cl N OS.
                           14 15  2 3

Молекулярная масса: 344,3.

Бесцветное или светло-бежевое твердое вещество без запаха.

Температура плавления: 139,1 — 144,5 °C. -7

    Давление паров при 20 °C: << 4 х 10   Па.
    Коэффициент распределения н-октанол/вода: K   log P = 4,16 (pH 4), 3,82

                                           ow

(pH 7) и 2,0 (pH 9).

    Растворимость  (г/л) при  20 °C: ацетон - более 250, этилацетат - более
250,  дихлорметан  - 88,  ацетонитрил - 69;  растворимость  в  воде - 0,005

(pH 4), 0,3 (pH 8) и 2,0 (pH 9).

Вещество стабильно при хранении на воздухе, а также в кислой (DT = 50 120 дней) и щелочной (DT => 1 года) средах. 50

В присутствии света в водных фотолитических условиях протиоконазол достаточно быстро деградирует с периодом полураспада 47,7 ч.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — более 6200 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для крыс — более 2000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — более 4990 мг/куб. м воздуха. 50

    Протиоконазол  не  оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую
оболочку  глаз,  не  обладает эмбриотоксическим или тератогенным действием.
LC   для рыб - 1,83 мг/л (96 ч).

50

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов.

Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665).

Альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1H-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.).

    Эмпирическая формула: C  H  Cl N O.
                           14 15  2 3

Молекулярная масса: 312,2.

Бесцветный порошок без запаха.

Температура плавления: 108,5 °C. -7

    Давление паров при 20 °C: 2,7 х 10   Па.
    Коэффициент распределения н-октанол/вода: K   log P = 3,04.

                                           ow

Растворимость (г/л) при 20 °C: гексан — 3, толуол — 84, ацетон — 100, ацетонитрил — 43, дихлорметан — более 200, вода — 0,051.

Метаболит стабилен в кислой и щелочной средах (DT => 500 ч). 50

Другие физико-химические и токсикологические характеристики протиоконазол-дестио отсутствуют.

Гигиенические нормативы для протиоконазола и протиоконазол-дестио в России не установлены.

Область применения препарата

Протиоконазол — фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке вегетирующих растений оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.

Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения — протиоконазол-дестио (альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1H-1,2,4-1-этанол) (SXX 0665). В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зерне и соломе зерновых колосовых культур по протиоконазол-дестио.

2. Методика определения остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на газохроматографическом определении протиоконазол-дестио (SXX 0665) с ЭЗД на неподвижной фазе OV-17 после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых колосовых культур.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Таблица

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МЕТОДА

Анализируемый	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
объект	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение S, %	относительное отклонение DS, %	доверительный интервал среднего, %
Зерно	0,02	0,02 — 0,2	88,6	5,3	2,4	+/- 4,9
Солома	0,1	0,1 — 1,0	83,6	3,6	1,6	+/- 3,4

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Протиоконазол-дестио с содержанием д.в. 98,5% (Байер, Германия)

Ацетон, ч.д.а. ГОСТ 2603-79

Вода бидистиллированная                                     ГОСТ 7602-72
Гексан, ч.                                                  ТУ 6-09-3375-78

Дихлорметан ГОСТ 12794-80

Калия перманганат ГОСТ 20490-75

Кальция хлорид, х.ч. ГОСТ 4161-77

Калий углекислый, х.ч. ГОСТ 4221-76

Кислота серная, х.ч. ГОСТ 4204-77

Натрия гидроксид, х.ч. ГОСТ 4328-77

Натрий двууглекислый ГОСТ 83-79

Натрия сульфат безводный, х.ч. ГОСТ 4166-76

Этилацетат ГОСТ 22300-76

Элюент № 1 для колоночной хроматографии:

смесь гексан-этилацетат (85:15, по объему)

Элюент № 2 для колоночной хроматографии:

смесь гексан-этилацетат (70:30, по объему)

Элюент № 1 для Диапак-диола: смесь

гексан-дихлорметан (1:1, по объему)

Алюминия оксид 90 (0,063 — 0,2 мм), нейтральный для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия) I степени активности по Брокману

Концентрирующий патрон Диапак-диол (ЗАО БиоХимМак СТ, Москва, Ленинские горы, МГУ)

Стекловата

Фильтры бумажные «синяя лента» ТУ 6-09-1678

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с ЭЗД с пределом детектирования по Линдану не выше -14 3,18 х 10 г/с или аналогичный

Колонка хроматографическая, набивная, стеклянная, 1000 х 3 мм, неподвижная фаза — 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 — 0,15 мм)

Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф                           ТУ 64-1-2850
Аппарат для встряхивания АВУ                                ТУ 64-1-1081-83
Весы аналитические типа ВЛР-200                             ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос                                          ГОСТ 10696-75

Колонка для адсорбционной хроматографии

Мельница электрическая, лабораторная ТУ 46-22-236-79 или аналогичная

Ротационный испаритель, тип ИР-1М ТУ 25-11-917-76

Баня ультразвуковая, модель D 50 Branson Instr.Co, США

Баня водяная ТУ 46-22-603-75

Воронка Бюхнера ГОСТ 0147-73

Воронки делительные вместимостью 100 мл ГОСТ 25336-82

Воронки для фильтрования стеклянные                         ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена                                               ГОСТ 5614-75
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100, 250 мл        ГОСТ 9737-70

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл ГОСТ 25336-82

Колбы мерные вместимостью 25, 50 и 100 мл ГОСТ 1770-74

Колбы грушевидные вместимостью 50 и 100 мл ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл ГОСТ 20292-74Е

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 мл ГОСТ 10515-75

Цилиндры мерные вместимостью 25, 50 и 100 мл ГОСТ 1770-74

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79).

Отобранные пробы зерна и соломы досушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре или в холодной комнате при температуре 4 °C. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

    Ацетон  перегоняют над перманганатом  калия и поташом  (на 1 л  ацетона
10 г KMnO  и 2 г K CO ).
         4        2  3

Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 4,6% воды к навеске оксида алюминия фирмы Мерк (Германия) I степени активности.

2.5.2 Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °C в течение 8 — 10 ч.

2.5.3 Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор протиоконазол-дестио с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0102 г вещества, содержащего 98,5% д.в., в этилацетате в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °C не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита соответствующим последовательным разведением этилацетатом.

При изучении полноты открывания протиоконазол-дестио в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

2.5.4 Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ x с от концентрации протиоконазол-дестио в растворе в мкг/мл.

2.5.5 Подготовка колонки с оксидом алюминия

для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г оксида алюминия III степени активности по Брокману в 20 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл смеси дихлорметан-ацетон (1:1, по объему), а затем 8 мл смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 мл/мин.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения

протиоконазол-дестио на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и наносят на подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 мл элюента № 1 (смесь гексан-этилацетат, 85:15) и затем 30 мл элюента № 2 (смесь гексан-этилацетат, 70:30) со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 2.7.

Фракции, содержащие протиоконазол-дестио, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл этилацетата и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1 Экстракция протиоконазол-дестио

К навеске размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70%-го водного ацетона и суспензию, перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл 70%-ного водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (соответственно около 35 и 25 мл), эквивалентную 5 г зерна или 1 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2, 2.6.3 и 2.6.4.

2.6.2 Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного экстракта (из п. 2.6.1) упаривают до водной фазы (объем около 5 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °C. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной воды, 30 мл дихлорметана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают дихлорметаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C.

2.6.3 Очистка на колонке с оксидом алюминия

К остатку в колбе, полученному при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, приливают 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты. Раствор переносят в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 25 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 25 мл смеси гексан-этилацетат (70:30, по объему) в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °C. Сухой остаток экстракта зерна растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7. Экстракт соломы подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак-диол.

2.6.4 Очистка на концентрирующем патроне Диапак-диол

Сухой остаток экстракта соломы из п. 2.6.3 переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 2.5.5). Патрон промывают 5 мл смеси гексан-дихлорметан (1:1, по объему) со скоростью 5 мл/мин., которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 12 мл дихлорметана. Элюат упаривают досуха в грушевидной колбе емкостью 50 мл на роторном испарителе при температуре 30 °C. Для удаления следовых количеств дихлорметана в колбу приливают 5 мл гексана и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования

    Газовый  хроматограф  "Кристалл 2000М"  с электронозахватным детектором
   63                                                        -14
(Ni  ) с пределом детектирования по Линдану не выше 3,18 х 10    г/с.

Колонка хроматографическая, стеклянная, 1000 х 3 мм, неподвижная фаза — 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 — 0,15 мм).

Температура детектора — 320 °C, испарителя — 270 °C, термостата колонки — 230 °C.

Скорость потока газоносителя (азот) — 30 мл/мин.; поддув — 25 мл/мин.

Объем вводимой пробы — 2 мкл.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 — 1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание протиоконазол-дестио рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                              H  x A x V
                               1

X = ----------, H x m 0

где: X — содержание протиоконазол-дестио в пробе, мг/кг; H — площадь пика образца, мВ x с; 1 H — площадь пика стандарта, мВ x с; 0

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m — масса анализируемой части образца, г (для зерна — 5 г, для соломы — 1 г).

При установлении уровня протиоконазола полученное значение содержания протиоконазола-дестио (X) умножают на 1,1.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

---