МУК 4.1.1961-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифеноконазола в воде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИФЕНОКОНАЗОЛА В ВОДЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде массовой концентрации дифеноконазола в диапазоне 0,0005 — 0,005 мг/куб. дм.

Цис,транс-3-хлор-4-[4-метил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил-метил)-1,3-диоксолан-2-ил-]фенил 4-хлорфениловый эфир (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

    Эмпирическая формула: C  H  Cl N O .
                           19 17  2 3 3

Молекулярная масса: 406,3.

Кристаллическое вещество белого или бледно-бежевого цвета. Температура -5

плавления  78,6  °С.  Давление паров при 25 °С: 3,3 х 10   мПа. Коэффициент
распределения н-октанол/вода: K   log P = 4,2. Растворимость в органических

                           ow

растворителях при 25 °С (г/куб. дм): ацетон — 610; этанол — 330; толуол — 490; н-октанол — 95; н-гексан — 3,4. Растворимость в воде при 25 °С (г/куб. дм): 0,015.

Дифеноконазол стабилен на воздухе при температуре до 150 °С, а также в водных растворах.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 1453 мг/кг, для мышей 50

2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов > 2010 50 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK ) для крыс >= 3300 мг/куб. м. 50

Область применения

Дифеноконазол — системный фунгицид, рекомендуемый к применению для борьбы с болезнями яблони, груши, свеклы и зерновых культур.

Гигиенические нормативы

ПДК в воде водоемов — 0,001 мг/куб. дм.

Метрологические характеристики метода (P = 0,95, n = 24)

Предел обнаружения: 0,0005 мг/куб. дм.

Диапазон определяемых концентраций: 0,0005 — 0,005 мг/куб. дм.

Среднее значение извлечения: 86,63%.

Стандартное отклонение: 5,37%.

Среда	Внесено дифеноконазола, мг/куб. дм	Обнаружено дифеноконазола, мг/куб. дм	Полнота извлечения, %
Вода	0,0005 0,001 0,0025 0,005	0,0004 +/- 0,0001 0,0009 +/- 0,0002 0,0022 +/- 0,0004 0,0044 +/- 0,0008	86,58 86,28 86,34 87,26

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы воды дихлорметаном и последующей очистки экстракта колоночной хроматографией на оксиде алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания сахарной и кормовой свеклы и яблок.

3.1 Средства измерений

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым Номер Госреестра 15945-97 детектором переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США)

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения, ГОСТ 7328 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные вместимостью 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см

Пробирки градуированные вместимостью ГОСТ 1770 5 или 10 куб. см

Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770. вместимостью 25, 50, 250, 500 и 1000 куб. см

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Дифеноконазол с содержанием действующего вещества 99,4% (ВНИИХСРЗ, Россия)

Алюминий оксид для хроматографии, по Брокману II, нейтральный (фирмы «Реанал», Венгрия)

Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или ГОСТ 6709 перегнанная над KMnO 4

н-Гексан, хч ТУ 6-09-33-75

Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794

Натрий серно-кислый, безводный, хч ГОСТ 4166

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч ГОСТ 22300.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3 Вспомогательные устройства, материалы

Бумажные фильтры «красная лента», обеззоленные ТУ 6-09-2678-77

Воронки делительные вместимостью 1000 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Груша резиновая ГОСТ 9737

Колбы плоскодонные вместимостью 200 — 250 куб. см ГОСТ 9737

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 100 и 250 куб. см

Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм

Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм

Насос водоструйный                                          ГОСТ 10696
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный      ТУ 25-11-917-74

вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария

Стаканы химические вместимостью 100 куб. см ГОСТ 25336

Стекловата

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая

Кромасил 100 С18, зернением 8 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с оксидом алюминия.

7.1 Подготовка органических растворителей

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2 Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3 Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см деионизованной воды, 800 куб. см ацетонитрила, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

7.3 Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) в течение 30 мин. при скорости подачи растворителя 1 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4 Приготовление градуировочных растворов

7.4.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г дифеноконазола, растворяют в 50 — 70 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонирилом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

Растворы № 1 — 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор № 1 дифеноконазола для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора дифеноконазола с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения дифеноконазола из исследуемых образцов.

7.4.3. Рабочие растворы № 2 — 6 дифеноконазола для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см)

В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 и 10 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 6 с концентрацией дифеноконазола 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 10 дней.

7.5 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации дифеноконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки № 2 — 6.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.6 Подготовка колонки с оксидом алюминия

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 4 г оксида алюминия в 15 — 20 куб. см этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. После этого колонка готова к работе.

7.7 Проверка хроматографического поведения

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора № 1 для градуировки (п. 7.4.2), упаривают досуха, добавляют 2 куб. см этилацетата, перемешивают и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Промывают колонку 50 куб. см этилацетата со скоростью 1 — 2 капли в с. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 5 куб. см подвижной фазы (приготовленной по п. 7.2), анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.3.

Фракции, содержащие дифеноконазол, объединяют и вновь анализируют.

Рассчитывают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Проверку хроматографического поведения дифеноконазола следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителя.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 17.1.3.03-77 «Правила выбора и оценки качества источников централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения».

Отобранные пробы воды анализируют в день отбора или хранят при 4 °С в течение 10-ти дней.

Непосредственно перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр.

9.1 Экстракция

Образец анализируемой воды объемом 400 куб. см помещают в делительную воронку вместимостью 1000 куб. см, добавляют 50 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний органический слой переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, фильтруя его через 2 см слой безводного сульфата натрия, помещенный в конусную химическую воронку диаметром 60 мм, снабженную бумажным фильтром «красная лента». Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды порциями хлористого метилена по 50 куб. см. Отстоявшийся слой хлористого метилена (нижняя фаза) фильтруют в колбу с ранее полученным экстрактом.

Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С, подвергают очистке в соответствии с п. 9.2.

9.2 Очистка экстракта

Остаток, полученный по п. 9.1, с помощью 1,5 — 2 куб. см этилацетата порциями переносят в колонку, подготовленную по п. 7.6, дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Дифеноконазол элюируют с колонки 25 куб. см этилацетата, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °С почти досуха, вносят в колбу 3 — 4 куб. см н-гексана, вновь упаривают. Операцию упаривания с н-гексаном повторяют трижды.

Сухой остаток в колбе растворяют в 2 куб. см подвижной фазы (приготовленной по п. 7.10) и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 9.3.

9.3 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Perkin-Elmer (США).

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Кромасил 100 С 18, зернением 8 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (80:20, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 230 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода дифеноконазола: 4,4 — 4,6 мин.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор дифеноконазола с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2.

Содержание дифеноконазола в пробе рассчитывают по формуле:

                                А х W

Х = -----, V

где:

Х — содержание дифеноконазола в пробе, мг/куб. дм;

А — концентрация дифеноконазола, найденная по градуировочному графику, в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

W — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

V — объем анализируемого образца, куб. см.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н. (Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана); Братина И.В. (Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора).

---