МУК 4.1.1949-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств имидаклоприда в зеленой массе, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зеленой массе, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. Роспотребнадзором 18.01.2005)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 18 апреля 2005 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека
Г. Г. Онищенко
18 января 2005 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМИДАКЛОПРИДА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
18 апреля 2005 года
1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.
1. ВВОДНАЯ ЧАСТЬ
Фирма-производитель: Байер КропСайенс (Германия).
Торговое название: КОНФИДОР, ГАУЧО.
Действующее вещество: имидаклоприд (NTN 33893).
1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (ИЮПАК).
1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (С.А.).
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H ClN O . 9 10 5 2
Бесцветное кристаллическое вещество со слабым характерным запахом.
Температура плавления: 144 °С. -7
Давление паров при 20 °С: 4 х 10 мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 0,57.
ow
Растворимость (г/л) при 20 °С: вода — 0,61, гексан — менее 0,1, дихлорметан — 55, изопропанол — 1,2, толуол — 0,68.
Вещество устойчиво к гидролизу при рН 5 — 11 (Т более 1 года). 1/2
Имидаклоприд относительно слабо передвигается по почвенному профилю и очень быстро разрушается в почве под действием света и микрофлоры. В
растениях соединение постепенно метаболизируется.
Краткая токсикологическая характеристика:
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 450 мг/кг; острая 50 дермальная токсичность (LD ) для крыс — более 5000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — 69 мг/куб. м воздуха 50
(аэрозоль). Имидаклоприд не вызывает раздражения слизистой оболочки глаз и кожи у кроликов. LC для рыб - 211 мг/л (96 час.).
50
Имидаклоприд практически нетоксичен для птиц, дождевых червей, водорослей, но опасен для пчел при прямом контакте.
Гигиенические нормативы для имидаклоприда в России: ПДК в почве — 0,04 мг/кг; ПДК в воде водоемов — 0,03 мг/куб. дм; МДУ в картофеле — 0,05, огурцах и томатах — 0,1 мг/кг.
Имидаклоприд — инсектицид нервно-паралитического действия, эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Вещество обладает системной активностью и может использоваться для обработки почвы и надземных органов растений.
Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ в виде препарата Гаучо КС (600 г имидаклоприда в 1 л препарата), предназначенного для протравливания семян и посадочного материала ряда культур, и препаратов Конфидор, ВРК (200 г/л) и Конфидор, ВДГ (700 г/кг), рекомендованных для обработки вегетирующих растений.
2. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМИДАКЛОПРИДА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ РАПСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод основан на определении имидаклоприда с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из зерна водным ацетоном, из зеленой массы и соломы ацетоном, из семян рапса ацетонитрилом, а из масла водным метанолом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонках с силикагелем или флоризилом.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
2.1.2 Избирательность метода
В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании зерновых колосовых культур и рапса.
2.1.3 Метрологическая характеристика метода
| Анализируемый объект | Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20 | |||||
| Предел обнаружения, мг/куб. дм, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/куб. дм, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение S, % | Относит. стандарт. отклонен. DS, % | Доверительный интервал среднего, % | |
| Зеленая масса | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 84,1 | 4,1 | 1,8 | +/- 3,8 |
| Зерно | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 82,7 | 4,1 | 1,8 | +/- 3,8 |
| Солома | 0,1 | 0,1 — 1,0 | 81,8 | 3,5 | 1,6 | +/- 3,5 |
| Зеленая масса рапса | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 83,3 | 4,0 | 1,8 | +/- 3,7 |
| Семена рапса | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 84,1 | 5,2 | 2,3 | +/- 4,8 |
| Масло | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 82,3 | 4,6 | 2,0 | +/- 4,2 |
2.2. Реактивы, растворы, материалы
Имидаклоприд с содержанием д.в. 99,6% (Байер, Германия)
Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-82
Вода бидистиллированная, ГОСТ 7602-72
Калия перманганат, ГОСТ 20490-75
Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77
Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76
Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77
Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79
Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77
Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76
Спирт метиловый, х.ч., ГОСТ 6995-77
Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69
Этилацетат, ГОСТ 22300-76
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (4:6 по объему)
Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (2:8 по объему)
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (25:75 по объему)
Силикагель для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) 1 степени активности или силикагель КСК (60 — 100 меш)
Флоризил (100 — 120 меш) для адсорбционной хроматографии (Вариан Аэрограф, США) 1 степени активности
Целит 535 (2 — 15 мкм) /Серва, Германия/ или аналогичный
Фильтры бумажные синяя лента, ТУ 6-09-1678
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный
Хроматографическая колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-C10CN или Диасорбом 130-C16T (ЗАО БиоХимМак, РФ, 119899, Москва, Ленинские горы)
Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф
Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75
Встряхиватель механический, ТУ 64-1-1081-83
Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная
Ротационный испаритель тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76
Сито с диаметром отверстий 1 мм
Воронки делительные вместимостью 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82
Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 9737-70
Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82
Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74
Колбы грушевидные вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е
Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75
Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Отобранные пробы зеленой массы зерновых злаков и рапса хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы растительного материала замораживают и хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы зерна, семян и соломы высушивают до стандартной влажности и хранят в холодной комнате при температуре 4 °С.
Перед анализом зерно, семена и солому размалывают на мельнице, а зеленую массу измельчают ножницами.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO и K CO ). 4 2 3
Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.
Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
2.5.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ
Отмеряют 250 мл ацетонитрила, переносят в колбу на 1000 мл, добавляют 750 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют, дегазируют.
2.5.3 Кондиционирование колонки
Промывают колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил — вода (25:75 по объему) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 0,6 мл/мин. Включают детектор и ждут стабилизации базовой линии (5 — 15 минут).
2.5.4 Приготовление стандартных растворов
Основной стандартный раствор имидаклоприда с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,6% д.в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °С не более месяца.
Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,04; 0,08; 0,20 и 0,40 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора имидаклоприда соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике не более трех дней.
При изучении полноты открывания имидаклоприда в модельных матрицах используются ацетонитрильные растворы вещества.
2.5.5 Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора имидаклоприда с концентрациями 0,04; 0,08; 0,20 и 0,40 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации имидаклоприда в растворе в мкг/мл (рис. 1 — не приводится).
2.5.6 Подготовка колонок с силикагелем и флоризилом для очистки экстракта
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г сорбента в 10 мл смеси гексан — этилацетат (2:8 по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонки последовательно промывают 40 мл смеси гексан — этилацетат (2:8 по объему) и 30 мл смеси гексан — этилацетат (4:6 по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего они готовы к работе.
2.5.7 Проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонках с силикагелем и флоризилом
В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента № 1 (гексан — этилацетат, 4:6) и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента № 1, затем 70 мл элюента № 2 (гексан — этилацетат, 2:8) со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.
Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.
Примечание: Профиль вымывания имидаклоприда может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
2.6. Описание определения
2.6.1 Экстракция имидаклоприда
2.6.1.1. Зеленая масса, солома. К навеске измельченной зеленой массы (25 г) или соломы (5 г) добавляют 125 мл ацетона и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Растительный остаток повторно экстрагируют 50 мл ацетона при встряхивании в течение 30 минут и суспензию фильтруют. Из объединенного ацетонового экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 5 г зеленой массы колосовых культур, 2,5 г зеленой массы рапса или 1 г соломы, добавляют к ней 20 мл воды и дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 - 2.6.4.
2.6.1.2. Зерно. К навеске (10 г) размолотого зерна добавляют 125 мл 75%-ного водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Растительный остаток повторно экстрагируют 50 мл 75%-ного водного ацетона при встряхивании в течение 30 минут и суспензию фильтруют. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 5 г зерна. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.
2.6.1.3. Семена рапса. К навеске (10 г) размолотых семян добавляют 125 мл ацетонитрила и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Растительный остаток повторно экстрагируют 50 мл ацетонитрила при встряхивании в течение 30 минут и суспензию фильтруют. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора, эквивалентную 2,5 г семян, добавляют к ней 20 мл воды и дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.4.
2.6.1.4. Масло. Навеску (5 г) масла помещают в коническую колбу емкостью 100 мл, приливают 50 мл 80%-ного водного раствора метанола и эмульсию энергично перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Эмульсию центрифугируют 5 минут при 6000 g и отделяют метанольную фазу. Масло повторно экстрагируют 30 мл 80%-ного водного раствора метанола и отделяют метанольную фазу центрифугированием. Объединенный метанольный экстракт пропускают через хлопчатобумажную вату и из фильтрата отбирают аликвоту, эквивалентную 2,5 г масла. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2. и 2.6.4.
2.6.2 Очистка экстракта
Отобранные аликвоты растительных экстрактов (из пп. 2.6.1.1 - 2.6.1.4) упаривают до водного остатка (около 10 мл) на роторном вакуумном испарителе
при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливают 20 мл насыщенного раствора NaCl, 10 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. Органический слой
отбрасывают. Обработку водной фазы гексаном повторяют еще раз. Затем водную фазу трижды обрабатывают дихлорметаном (30 + 30 + 20 мл) при встряхивании. Объединенный дихлорметановый экстракт промывают в делительной воронке 20 мл
0,05 М раствора K CO , а затем пропускают через слой безводного сульфата
2 3
натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С.
Дальнейшую очистку экстрактов растительных образцов колосовых культур
проводят по п. 2.6.3.
Для дополнительной очистки растительных образцов рапса полученные сухие остатки зеленой массы, семян и масла растворяют в 30 мл ацетонитрила. Растворы переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 10 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. Гексан отбрасывают, а ацетонитрильные экстракты упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Дальнейшую очистку экстрактов образцов рапса проводят по п. 2.6.4.
2.6.3 Очистка экстрактов зеленой массы, зерна и соломы колосовых культур на колонке с силикагелем
Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 растительных образцов колосовых культур, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан — этилацетат (4:6 по объему) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Колонку промывают 50 мл элюента № 1, которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 70 мл элюента № 2 и собирают элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.
2.6.4 Очистка экстрактов зеленой массы, семян и масла рапса на колонке с флоризилом
Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 растительных образцов рапса, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан — этилацетат (4:6 по объему) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Колонку промывают 50 мл элюента № 1, которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 55 мл элюента № 2, отбрасывая первые 10 мл элюата и собирая последующие 45 мл в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1,25 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.7.
2.7. Условия хроматографирования
Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США)
Колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасорб 130-C10CN (7 мкм)
Температура колонки: комнатная
Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (25:75 по объему)
Скорость потока элюента: 0,6 мл/мин.
Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу
Время выхода имидаклоприда: 5 мин. 36 сек.
Линейный диапазон детектирования: 2 — 20 нг
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,4 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.
Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-C16T (5 мкм)
Подвижная фаза: метанол — вода (50:50 по объему)
Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин.
Время выхода имидаклоприда: 5 мин. 20 сек.
2.8. Обработка результатов анализа
Содержание имидаклоприда рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
Н х А х V
1
где:
Х - содержание имидаклоприда в пробе, мг/кг;
Н - высота пика образца, мм;
1
Н - высота пика стандарта, мм;
0
А - концентрация стандартного раствора имидаклоприда, мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;
m - масса анализируемой части образца, г (для зеленой массы и зерна колосовых культур - 5 г, соломы - 1 г; для зеленой массы, семян и масла
рапса — 2,5 г).
3. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.
4. КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».
5. РАЗРАБОТЧИКИ
ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.