МУК 4.1.1911-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Ивермектина в печени, почках, мышцах и жире сельскохозяйственных животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 01.01.2004)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИВЕРМЕКТИНА В ПЕЧЕНИ, ПОЧКАХ, МЫШЦАХ И ЖИРЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.1911-04

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в печени, почках, мышцах и жире сельскохозяйственных животных массовой концентрации ивермектина в диапазонах 0,001 — 0,02 мг/кг (печень, почки, мышцы); 0,002 — 0,04 мг/кг (жир).

Ивермектин — действующее вещество ветеринарного препарата Баймек 1% ИР, фирма-производитель Байер АГ (Германия).

    Ивермектин  -  смесь  компонентов  H B   и H B  . Содержание компонента
                                        2 1a    2 1b
H B   не менее 80%.

2 1a

Компонент H B — (2аЕ,4Е,8Е)-(5'S,6S,'R,7S,11R,13R,15S,17aR,20R,20aR, 2 1a 20bS)-20,20b-дигидрокси-5',6,8,19-тетраметил-7-[[(3-О-метил-4-О-(3-О-метил- 2,6-дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил)-2,6-дидеокси-альфа-L-арабино- гексапиранозил]-окси]-6'-[(1S)-1-метилпропил]-3',4',5',6,6',7,10,11,14,15, 17а,20,20а-,20b-тетрадека-гидроспиро[11,15-метано-2Н,13Н,17Н-фуро[4,3,2pq] [2,6]бензодиокса-циклоокта-децен-13,2'-[2Н]пиран]-17-он (или 5-О-диметил- 22,23-дигидроавермектин А ). 1а

Компонент H B — (2аЕ,4Е,8Е)-(5'S,6S,'R,7S,11R,13R,15S,17aR,20R,20aR, 2 1b 20bS)-20,20b-дигидрокси-5',6,8,19-тетраметил-6'-(1-метилэтил)-7-[[(3-О- метил-4-О-(3-О-метил-2,6-дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил)-2,6- дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил]-окси]-3',4',5',6,6',7,10,11,14,15, 17a,20,20a-,20b-тетрадека-гидроспиро[11,15-метано-2Н,-13Н,17Н-фуро[4,3,2pq] [2,6]бензодиокса-циклоокта-децен-13,2'-[2Н]пиран]-17-он (или 25-(1- метилэтил)-5-О-диметил)-25-де(1-метилпропил)-22,23-дигидроавермектин А ). 1a

Структурная формула (не приводится).

Компонент         R               Эмпирическая формула   Молекулярная масса
**H B               CH -CH          C  H  O                875**
 2 1a               2   3          48 74 14
**H B               CH              C  H  O                861**
 2 1b               3              47 72 14

Ивермектин — кристаллический порошок без запаха, цвет от белого до желтовато-белого. Насыпная плотность от 1,1 до 1,3 г/куб. см. Практически нерастворим в воде (около 10 мкг/куб. дм при 21 °С), плохо растворим в алифатических углеводородах и циклогексане. Растворим в этиловом спирте, хорошо растворим в метиленхлориде, метилэтилкетоне, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле. Ивермектин получают путем селективного каталитического восстановления абамектина, который, в свою очередь, является продуктом жизнедеятельности почвенных организмов Streptomyces avermitilis.

Температура плавления 150 — 155 °С.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс: 42,8 — 52,8 мг/кг, для 50 мышей: 11,6 — 87,2 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс > 50

660  мг/кг,  для  кроликов  -  406  мг/кг; острая ингаляционная токсичность
(LK  ) для крыс > 5110 мг/куб. м.

50

Область применения препарата

Баймек 1% ИР используется в качестве антипаразитарного и антигельминтного средства (против нематод, вшей, кровососок, возбудителей саркоптоидозов, личинок овода и других членистоногих) для крупного рогатого скота, овец, свиней путем подкожного введения.

Гигиенические нормативы

ДСД — 0,001 мг/кг массы тела

МДУ:

• для крупного рогатого скота: печень — 0,1 мг/кг, жир — 0,04 мг/кг; мясо — не требуется;
• для овец и свиней: печень — 0,015 мг/кг, жир — 0,02 мг/кг; мясо — не требуется.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 24
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего результата, %
Печень	0,001	0,001 — 0,02	83,48	6,21	6,5
Почки	0,001	0,001 — 0,02	82,89	5,15	5,4
Мышцы (мясо)	0,001	0,001 — 0,02	82,93	5,45	5,7
Жир	0,002	0,002 — 0,04	84,00	5,69	5,9

Таблица 2

(6 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено ивермектина, мг/кг	Обнаружено ивермектина, мг/кг	Полнота извлечения, %
1	2	3	4
Печень (свиная)	0,001 0,002 0,01 0,02	0,000804 +/- 0,000078 0,001691 +/- 0,000205 0,008292 +/- 0,000692 0,017209 +/- 0,002747	80,44 84,54 82,92 86,04
Почки (свиные)	0,001 0,002 0,01 0,02	0,0008066 +/- 0,000076 0,001624 +/- 0,000136 0,008514 +/- 0,000244 0,016932 +/- 0,002236	80,58 81,19 85,14 84,66
Мышцы (мясо, свинина)	0,001 0,002 0,01 0,02	0,0007940 +/- 0,000077 0,001722 +/- 0,000241 0,008387 +/- 0,000701 0,016676 +/- 0,001632	79,40 86,09 82,87 83,38
Жир свиной	0,002 0,004 0,02 0,04	0,001678 +/- 0,000211 0,003302 +/- 0,000290 0,017031 +/- 0,002494 0,033761 +/- 0,003936	83,89 82,56 85,16 84,40

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором после экстракции из анализируемой пробы органов и тканей сельскохозяйственных животных этилацетатом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, превращения ивермектина во флуорогенное производное и последующей очистки на патроне для твердофазной экстракции Florisil Sep Pak.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с флуориметрическим детектором      Номер Госреестра
с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США)        15945-97

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим ГОСТ 7328 пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 и 2-1000-2 ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Пипетки градуированные 2-го класса точности ГОСТ 29227 вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см

Пробирки градуированные вместимостью 5 или 10 куб. см ГОСТ 1770

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью ГОСТ 1770 10, 25, 50, 100, 200, 500 и 1000 куб. см

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Ивермектин с содержанием компонента H B   - 83,9%; H B
                                     2 1a           2 1b

• 5,9% (Байер АГ, Германия)

Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ 6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная ГОСТ 6709 над KMnO 4

н-Гексан, хч ТУ 6-09-3375

Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995

1-N-метилимидазол, puriss. for DNA synthesis, >= 99%, Fluka

Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233

Трифторуксусный ангидрид, purum; >= 98,0% (GC), Fluka

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч ГОСТ 22300

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78

Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)

Воронки делительные вместимостью 150 и 250 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Гомогенизатор

Груша резиновая

Колбы плоскодонные вместимостью 200 — 250 куб. см ГОСТ 9737

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 50, 100 и 250 ГОСТ 9737 куб. см

Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм

Насос водоструйный ГОСТ 10696

Патроны для твердофазной экстракции Florisil Sep Pak (Waters, США)

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный ТУ 25-11-917-74 вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария

Стаканы химические вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336

Стекловата

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Шприц медицинский с разъемом Льюера ГОСТ 22090

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на патронах для твердофазной экстракции.

7.1 Подготовка органических растворителей

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2 Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, далее водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.3 Очистка этилацетата

Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 980 куб. см метанола, добавляют 20 куб. см бидистиллированной или деионизированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3 Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 2 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4 Приготовление реактива для дериватизации

Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объеме 1:2. Реактив годен к употреблению в течение рабочего дня.

7.5 Приготовление градуировочных растворов

7.5.1 Исходный раствор ивермектина для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,0100 г ивермектина, растворяют в 50 — 70 куб. см ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере в течение месяца.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.5.2 Раствор № 1 ивермектина для градуировки (концентрация 1 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного градуировочного раствора ивермектина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют ацетонитрилом до метки. Раствор хранится в морозильной камере в течение 10-ти дней.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения ивермектина из исследуемых образцов.

7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 5 ивермектина для градуировки (концентрация 0,005 — 0,1 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5; 1,0; 5,0 и 10,0 куб. см стандартного раствора № 1 с концентрацией 1 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией ивермектина 0,005; 0,01; 0,05 и 0,10 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в морозильной камере не более недели.

7.6 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (mV х сек.) от концентрации ивермектина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам флуорогенного производного ивермектина для градуировки.

Для построения градуировочной характеристики в градуированные пробирки вместимостью 5 куб. см вносят по 1 куб. см каждого из 4-х рабочих растворов ивермектина № 2 — 5, прибавляют по 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 — 5 °С, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (п. 7.4), перемешивают и выдерживают час при комнатной температуре.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.7 Подготовка патрона для очистки экстрактов

Патрон для твердофазной экстракции устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 куб. см, используемый в качестве емкости для элюента.

---

<*> В отсутствии специального аллонжа жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость прохождения раствора не должна превышать 1 — 2 капли в сек.

Концентрирующий патрон промывают 5 куб. см метанола, высушивают пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Затем через патрон пропускают 5 куб. см гексана. Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин., при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

8. Отбор проб

Отбор проб осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо».

Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при -20 °С (допускается хранение до 2-х месяцев).

Непосредственно перед анализом образцы размораживают, пробы органов и тканей массой 200 — 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца печени, почек и мяса массой 10 г, жира массой 5 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 куб. см.

9. Выполнение определения

9.1 Экстракция

К пробе гомогенизированного образца (10 г печени, почек, мяса, 5 г жира), помещенной в колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 100 куб. см этилацетата, тщательно перемешивают путем встряхивания, выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин., помещают на встряхиватель на 30 мин., дополнительно выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин. и снова помещают на встряхиватель на 30 мин.

Надосадочную жидкость переносят в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, фильтруя ее через тампон из стекловаты, помещенный в конусную химическую воронку. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Остаток растворяют в 30 куб. см гексана, переносят в делительную воронку вместимостью 150 куб. см, добавляют 20 куб. см ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в круглодонную колбу. В воронку добавляют новую порцию ацетонитрила объемом 20 куб. см, вновь интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в круглодонную колбу, объединяя его с первым экстрактом, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяют в 30 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:1), помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, 70 куб. см гексана, интенсивно встряхивают воронку в течение 1 мин. Верхний органический слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Водно-ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию экстракции, используя 70 куб. см гексана.

Объединенную органическую фазу упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и подвергают дериватизации по п. 9.2.

9.2 Дериватизация

К ацетонитрильному раствору прибавляют 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 — 5 °С, помещая колбу в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (п. 7.4), перемешивают и выдерживают 1 час при комнатной температуре.

Дериватизированные экстракты подвергают очистке по п. 9.3.

9.3 Очистка экстракта

Аликвоту раствора после дериватизации объемом 0,7 куб. см переносят в градуированную пробирку вместимостью 5 куб. см, добавляют 5 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., верхний гексановый слой отбирают с помощью пипетки, перенося в стакан вместимостью 50 куб. см, операцию экстракции повторяют новой порцией гексана объемом 5 куб. см. Верхний гексановый слой также переносят в химический стакан, объединяя с первым экстрактом. Объединенный гексановый экстракт вносят на патрон для твердофазной экстракции Florisil Sep Pak, подготовленный по п. 7.7. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 — 2 капли в сек. Элюат собирают непосредственно в круглодонную колбу.

Флуорогенное производное ивермектина дополнительно элюируют с патрона 5 куб. см гексана, также объединяя элюат с первой порцией в круглодонной колбе. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 1,4 куб. см ацетонитрила и анализируют на содержание ивермектина по п. 9.4.

9.4 Условия хроматографирования

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол — вода (98:2, по объему)

Скорость потока элюента: 2 куб. см/мин.

Длина волны: возбуждение 364 нм

эмиссия 470 нм

Показание аттенюатора: 64

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода флуорогенного производного ивермектина: около 10 мин.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ивермектина с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание ивермектина в пробе рассчитывают по формуле:

                               (A х K)

X = -------, m

где:

X — содержание ивермектина в пробе, мг/кг;

A — концентрация ивермектина, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

m — масса анализируемого образца, г;

K — коэффициент пересчета, учитывающий объем реакционной смеси после дериватизации, используемый для анализа, равный 2.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

12. Разработчики

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).

---