МУК 4.1.1850-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств ацетамиприда в воде, почве, ботве и клубнях картофеля, зерне и соломе зерновых колосовых культур

(утв. Минздравом России 05.03.2004)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АЦЕТАМИПРИДА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, БОТВЕ И КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР

МУК 4.1.1850-04

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

1. Вводная часть

Торговое наименование: Снейк.

Фирма-производитель: Агротрейд.

Действующее вещество: Ацетамиприд.

Структурная формула (не приводится). 1 2 1

(E)-N -[(6-хлор-3-пиридил)метил]-N -циано-N -метилацетамидин (IUPAC).

(E)-N-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N'-циано-N-метилэтанимидамид (CA).

    Брутто формула: C  H  ClN .
                     10 11   4

Мол. масса: 222,7.

Химически чистый ацетамиприд представляет собой бесцветные кристаллы.

Температура плавления 98,9 °С. -3

    Давление паров: < 1 х 10   мPa (25 °С).
    Коэффициент     распределения    в    системе    н-октанол    -    вода
K   lg P = 0,80 (25 °С).

ow

Растворимость при 25 °С в воде — 4,25 г/л. Растворим в ацетоне (> 200 г/л), метаноле, этаноле, дихлорметане, хлороформе (> 200 г/л), ацетонитриле (> 200 г/л) и тетрагидрофуране.

Стабилен в буферных растворах при pH 4, 5, 7. Медленно разлагается при pH 9 (период полураспада 420 дней). Устойчив к воздействию солнечного света, pKa 0,7.

Медленно деградирует на (или в) растениях с образованием 5 идентифицированных метаболитов.

Острая пероральная токсичность LD для крыс: самцы — 217 мг/кг; самки 50

• 146 мг/кг. Острая дермальная токсичность LD (14 дней) для крыс обоих 50

полов  -  более  2000  мг/кг. Не ирритант для глаз и кожи (кролики). Острая
ингаляционная  токсичность  LC   (4 часа) для крыс обоих полов - более 0,29

                          50

мг/л. LC (24 — 96 часов): для карпа — более 100 мг/л: для дафнии — более 50 200 мг/л.

2. Методика определения ацетамиприда в воде, почве, ботве и клубнях картофеля, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении ацетамиприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, P = 0,95
Вода	0,002	0,002 — 0,02	88,7	6,9	6,0
Почва	0,01	0,01 — 0,1	83,8	6,9	6,0
Ботва картофеля	0,02	0,02 — 0,2	85,1	6,7	5,9
Клубни картофеля	0,01	0,01 — 0,1	86,8	6,7	5,9
Солома зерновых колосовых	0,04	0,04 — 0,4	82,9	6,4	5,6
Зерно зерновых колосовых	0,01	0,01 — 0,1	83,0	6,5	5,7

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, +/-	Полнота определения, %
1	2	3	4	5
Вода	0,002	0,00182	0,00013	91,0
	0,004	0,00361	0,00028	90,3
	0,01	0,00861	0,00077	86,1
	0,02	0,0175	0,0013	87,5
Среднее				88,7
Почва	0,01	0,00852	0,0008	85,2
	0,02	0,0169	0,0014	84,5
	0,05	0,0417	0,0029	83,3
	0,1	0,0821	0,0069	82,1
Среднее				83,8
Ботва картофеля	0,02	0,0167	0,0013	83,6
	0,04	0,0343	0,0031	85,8
	0,1	0,0850	0,0052	85,0
	0,2	0,1716	0,0154	85,8
Среднее				85,1
Клубни картофеля	0,01	0,00859	0,0007	85,9
	0,02	0,0174	0,0015	87,0
	0,05	0,043	0,0032	86,2
	0,1	0,0879	0,0059	87,9
Среднее				86,8
Солома зерновых	0,04	0,0323	0,0030	80,8
колосовых	0,08	0,0681	0,0051	85,1
	0,2	0,163	0,011	81,4
	0,4	0,338	0,025	84,4
Среднее				82,9
Зерно зерновых	0,01	0,00811	0,0007	81,1
колосовых	0,02	0,0167	0,0013	83,7
	0,05	0,0422	0,0036	84,4
	0,1	0,0827	0,0051	82,7
Среднее				83,0

2.1.3 Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, осч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Ацетамиприд, аналитический стандарт с содержанием д.в. 100% (Nippon Soda Co., Ltd).

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (25:75, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 — 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (50:50, по объему).

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (10:90, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry C-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry C-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно (семена) и солому измельчают на лабораторной мельнице. Пробы ботвы и клубней картофеля хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца. Перед анализом их гомогенизируют.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен

встряхивают  с  небольшими  порциями  концентрированной  серной  кислоты до
прекращения  окрашивания  свежей  порции  кислоты,  затем  промывают водой,
2%-ным  раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над
гидроксидом  натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия
и  поташем  (на  1 л ацетона 10 г KMnO  и 2 г K CO ). Ацетонитрил сушат над
                                      4        2  3
пентоксидом   фосфора   и   перегоняют;  отогнанный  растворитель  повторно
перегоняют  над  углекислым  калием.  Этилацетат  промывают  равным объемом
5%-ного  раствора  двууглекислого  натрия,  сушат  над хлористым кальцием и

перегоняют.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.

2.5.3 Приготовление растворов

Для получения 50%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для получения 75%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

    Для приготовления 0,05 М раствора K CO  6,9  г карбоната калия помещают
                                       2  3
в  мерную  колбу  емкостью  1000  куб.  см,  растворяют  при  перемешивании

в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для приготовления 1 М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для приготовления 0,02 М раствора NaOH 20 мл 1 М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 25:75 по объему, используя мерные цилиндры.

Берут точную навеску ацетамиприда (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор концентрацией 0,5 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил — вода (20:80, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При изучении полноты открывания ацетамиприда используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация ацетамиприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ацетамиприда в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 мл смеси гексан — этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 мл элюента № 2 и 30 мл элюента № 1 со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения ацетамиприда на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора ацетамиприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 мл элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента № 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 100 мл элюента № 1, которые отбрасывают, затем 100 мл элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание ацетамиприда по п. 2.6.7.

Фракции, содержащие ацетамиприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.7. Рассчитывают содержание ацетамиприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания ацетамиприда и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7 Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1 Определение ацетамиприда в пробах воды

Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл помещают делительную воронку емкостью 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по

20 м,  встряхивая  каждый  раз в течение 2 - 3 мин. Верхний гексановый слой
отбрасывают,  водную  фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями
по 30 мл, встряхивая делительную воронку  каждый раз в течение 2 - 3 мин. и
собирая  нижний  органический  слой.  Объединенный метиленхлоридный раствор
промывают в делительной воронке дважды 0,05 М раствором K CO   порциями  по
                                                         2  3
30 мл, пропускают через слой  безводного  сульфата  натрия (2 г), осушитель
промывают  10  -  15 мл хлористого метилена. После этого экстракт упаривают
досуха  на  ротационном  испарителе  при  температуре  не  выше  40 °С. При
необходимости  проводят  дополнительную  очистку  экстракта  на  колонке  с

силикагелем и пункту 2.6.6. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2 Извлечение ацетамиприда из проб почвы

Образец воздушно-сухой почвы массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 100 мл 50%-ного водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 мл 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (70 — 75 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.3. Извлечение ацетамиприда из проб зерна и соломы зерновых колосовых и ботвы картофеля.

Навеску измельченной на ножевой мельнице соломы (5 г) или пастбищных трав (10 г), размолотого на лабораторной мельнице зерна (20 г) или гомогенизированной ботвы картофеля (10 г) помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон — вода (1:1, по объему) и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 мл 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (75 — 80 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.4 Извлечение ацетамиприда из клубней картофеля

Гомогенизированную пробу клубней картофеля массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл и экстрагируют ацетамиприд 50 мл 75%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр «красная лента». Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу. Экстракцию проводят еще дважды. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона (объем 80 — 90 мл). Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

2.6.5 Очистка экстрактов

Полученные по п. п. 2.6.2 - 2.6.4 водные экстракты промывают в делительной воронке объемом 250 мл трижды гексаном порциями по 30 мл (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1 — 2 минут. Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 — 3 мин. и собирая нижний органический слой <*>. Объединенный метиленхлоридный раствор промывают в делительной воронке дважды 0,02 М раствором NaOH порциями по 30 мл, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл хлористого метилена. После этого экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.6 <**>.

---

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном — небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта, а на стадии переэкстракции — насыщенный раствор хлорида натрия (15 — 20 мл).

<**> В случаях когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.4) дает удовлетворительные результаты, дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.6 Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.5 экстрактов почвы и растительных материалов, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан — этилацетат (50:50 по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 100 мл элюента № 1. Элюат отбрасывают. Ацетамиприд элюируют 75 мл элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 мл. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.7 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487).

Рабочая длина волны 244 нм.

Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry C-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода в соотношении 25:75.

Скорость потока 1 мл/мин.

Время удерживания ацетамиприда 9,3 +/- 0,1 мин.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,1 — 2,0 мкг/мл.

2.6.8 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание ацетамиприда в образцах воды, почвы или растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                              S  х C х V
                               2

X = ----------, S х P 1

где:
S  - площадь пика ацетамиприда в стандартном растворе, мм;
 1
S  - площадь пика ацетамиприда в анализируемой пробе, мм;
 2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
P - навеска анализируемого образца, г (для воды - объем, мл);
C - концентрация стандартного раствора ацетамиприда, мкг/мл.
Содержание  остаточных  количеств  ацетамиприда в анализируемом образце

вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ацетамиприда 2

3. Требования техники безопасности

4. Контроль погрешности измерений

5. Разработчики

ВНИИ защиты растений.

---