МУК 4.1.1836-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств пирипроксифена в зеленой массе, огурцах и томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 13.02.2004)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПИРИПРОКСИФЕНА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, ОГУРЦАХ И ТОМАТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.1836-04

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-регистрант: Агропрогресс.

Торговое наименование: Адмирал.

Действующее вещество: пирипроксифен.

Структурная формула (не приводится).

4-феноксифенил (RS)-2-(2-пиридилокси)пропиловый эфир (IUPAC).

2-[1-метил-2-(4-феноксифенокси)этокси]пиридин (С.А.).

    Брутто формула: C  H  NO .
                     20 19  3

Мол. масса: 321,5.

Бесцветные кристаллы (технический — бледно-желтое воскообразное вещество со слабым запахом).

Температура плавления: 47 °С.

Давление паров при 23 °С менее 0,013 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 5,37 (25 °С). ow

Растворимость (г/кг): гексан — 400, метанол — 200, ксилол — 500 (20 — 25 °С). Растворимость в воде — 0,367 мг/л (при 25 °С).

Вещество устойчиво к гидролизу: период полураспада — более 367 дней (20 °С, pH 4 — 9).

    Краткая токсикологическая характеристика. Острая  оральная  токсичность
(LD  ) для крыс > 5000 мг/кг;  острая  дермальная  токсичность  (LD  ), для
   50                                                              50

крыс > 2000 мг/кг, не раздражает кожу и слизистую глаз (кролики).

Класс токсичности по ВОЗ — III.

Гигиенические нормативы для пирипроксифена в России не установлены.

Область применения препарата. Пирипроксифен — инсектицид контактного и кишечного действия из группы аналогов ювенильного гормона, подавляющий эмбриогенез и процесс метаморфоза насекомых. Активно подавляет развитие мух, жуков, комаров и других насекомых.

2. Методика определения пирипроксифена в зеленой массе, огурцах и томатах методом ВЭЖХ

2.1 Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении пирипроксифена методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с флорисилом.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, P = 0,95
Зеленая масса	0,02	0,02 — 0,2	87,9	8,61	7,55
Огурцы	0,01	0,01 — 0,1	90,3	7,84	6,87
Томаты	0,01	0,01 — 0,1	91,0	8,11	7,10

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, S, +/-	Полнота определения, %
1	2	3	4	5
Зеленая масса	0,02	0,01734	-3 1,89 х 10	86,7
	0,04	0,03564	-3 3,64 х 10	89,1
	0,1	0,0885	-3 8,22 х 10	88,5
	0,2	0,1746	-2 1,53 х 10	87,3
Среднее				87,9
Огурцы	0,01	0,00893	-4 8,21 х 10	89,3
	0,02	0,01794	-3 1,61 х 10	89,7
	0,05	0,04545	-3 3,93 х 10	90,9
	0,1	0,0912	-3 7,22 х 10	91,2
Среднее				90,3
Томаты	0,01	0,00935	-4 8,07 х 10	93,5
	0,02	0,01794	-3 1,59 х 10	89,7
	0,05	0,0444	-3 4,15 х 10	88,8
	0,1	0,0919	-3 8,13 х 10	91,9
Среднее				91,0

2.1.3 Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2 Реактивы и материалы

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Пирипроксифен, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (75:25, по объему).

Стекловата.

Флорисил 150 — 250 мю m (Merck, Германия).

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: гексан — хлористый метилен (70:30, по объему).

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: гексан — хлористый метилен (60:40, по объему).

2.3 Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный.

Колонка Symmetry — C18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry C-18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ100 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ100 29/32 и КШ10 14/19 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

2.4 Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Перед проведением анализа пробы огурцов и томатов гомогенизируют в гомогенизаторе.

2.5 Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен

встряхивают  с  небольшими  порциями  концентрированной  серной  кислоты до
прекращения  окрашивания  свежей  порции  кислоты,  затем  промывают водой,
2%-ным  раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над
гидроксидом  натрия и перегоняют. Ацетон перегоняют над перманганатом калия
и поташом (на 1 л ацетона 10 г KMnO  и 2 г K CO ). Ацетонитрил, х.ч., сушат
                                   4        2  3
над  пентаксидом  фосфора  и  перегоняют;  отогнанный растворитель повторно

перегоняют над углекислым калием.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.

2.5.3 Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 мл ацетона и 250 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 750 мл ацетонитрила с 250 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента № 1 в колбе на 1000 мл смешивают 700 мл н-гексана и 300 мл хлористого метилена. Для приготовления элюента № 2 в колбе на 1000 мл смешивают 600 мл н-гексана и 400 мл хлористого метилена.

2.5.4 Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску пирипроксифена (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (Стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил — бидистиллированная вода (75:25, по объему).

Растворы пирипроксифена для внесения в образец при определении полноты извлечения готовят растворением навески пирипроксифена (5 мг) в 100 мл гексана (раствор с концентрацией 50 мкг/мл) с последующим разбавлением полученного раствора гексаном в 50 и 100 раз (растворы внесения с концентрациями 1,0 и 0,5 мкг/мл), используя мерные колбы емкостью 50 и 100 мл.

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы и растворы внесения — в течение суток.

2.5.5 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация пирипроксифена в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пирипроксифена в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6 Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 30 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из ваты и вносят суспензию 5 г флорисила в 20 мл элюента № 1. Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя флорисила, на него насыпают слой сернокислого натрия толщиной 10 — 15 мм. Колонку промывают 40 мл элюента № 2, затем 40 мл элюента № 1 со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7 Проверка хроматографического поведения пирипроксифена на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 1 мл раствора внесения пирипроксифена с концентрацией 1 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента № 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента № 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента № 1, затем 100 мл элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание пирипроксифена по п. 2.6.4.

Фракции, содержащие пирипроксифен, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание пирипроксифена в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания пирипроксифена может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8 Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6 Проведение определения

2.6.1 Экстракция пирипроксифена из проб зеленой массы, огурцов и томатов

Гомогенизированные пробы зеленой массы, массой 10 г, огурцов и томатов, массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой, добавляют 50 мл 50%-го водного ацетона (для зеленой массы) или 75%-го водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента». Экстракцию повторяют еще дважды с 50 мл водно-ацетоновой смеси. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (50 — 75 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Очистку экстрактов проводят по пункту 2.6.2.

2.6.2 Очистка экстрактов

Объем водного остатка доводят до 100 мл, фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр «красная лента», переносят в делительную воронку объемом 250 мл и экстрагируют трижды гексаном порциями по 40 мл, встряхивая каждый раз в течение 2 — 3 минут и собирая после расслаивания верхний гексановый слой <*>. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл гексана. Полученный раствор выпаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С досуха. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

---

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий на стадии экстракции гексаном для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.

2.6.3 Очистка на колонке с флорисилом

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. п. 2.6.1 и 2.6.2 экстрактов растительного материала, растворяют в 5 мл элюента № 1 и количественно переносят в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Колбу обмывают еще 5 мл элюента № 1. Промывают колонку 50 мл элюента № 1, которые отбрасывают. Пирипроксифен элюируют 80 мл элюента № 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка Symmetry-C18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Температура колонки: 30 +/- 1 °С.

Предколонка Waters Symmetry C-18 (20 х 3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода в соотношении 75:25 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны: 272 нм.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Время удерживания пирипроксифена 10,3 +/- 0,1 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 — 2,00 мкг/мл.

2.6.5 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание пирипроксифена в образце воды, почвы или растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

                             S  х C х V
                              2

X = ----------, S х P 1

где:
S  - площадь пика пирипроксифена в стандартном растворе, ед.адс.хс;
 1
S  - площадь пика пирипроксифена в анализируемой пробе, ед.адс.хс;
 2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
P - навеска анализируемого образца, г (для воды - объем, мл);
C - концентрация стандартного раствора пирипроксифена, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств пирипроксифена в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор пирипроксифена 2 мкг/мл разбавляют.

3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. Разработчики

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.

---