МУК 4.1.1833-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств беномила по карбендазиму и карбендазима в винограде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 13.02.2004)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ БЕНОМИЛА ПО КАРБЕНДАЗИМУ И КАРБЕНДАЗИМА В ВИНОГРАДЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.1833-04

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

1.1 Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.

Торговое наименование: Фундазол.

Действующее вещество: беномил.

Структурная формула: (не приводится).

Метил 1-(бутилкарбомоил) бензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).

Брутто-формула: C H № O . 14 18 4 3

Мол. масса: 290,3.

Бесцветный кристаллический порошок без запаха. Температура плавления:

• 140 °С, плавится с разложением. Давление паров при 25 °С: < 0,005 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 1,37. ow

Растворимость (г/кг) при 25 °С: ацетон — 18, диметилформамид — 53, этанол — 4, ксилен — 10, хлороформ — 94, гептан — 0,4.

Растворимость в воде при комнатной температуре: 3,6 мкг/л (при pH 5), 2,9 мкг/л (при pH 7), 1,9 мкг/л (при pH 9).

Гидролиз DT 3,5 часа при pH 5, 1,5 часа при pH 7, < 1 часа при pH 9 50

(при  25  °С).  В  некоторых  растворителях  диссоциирует до карбендазима и
бутилизоцианата.  В  водных растворах, во влажной почве, в присутствии воды

при хранении быстро разлагается. Стабилен при хранении при температуре ниже 50 °С в отсутствии света и влаги.

    В  объектах  внешней  среды  беномил  быстро превращается в значительно
более стабильный Карбендазим с DT   19 часов и в воде 2 часа. Такой процесс

                             50

происходит и в растениях.

    Краткая   токсикологическая   характеристика.   Беномил   относится   к
малотоксичным  веществам/ Острая  пероральная токсичность (LD  ) для крыс -

                                                         50

более 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов — более 50 5000 мг/кг; средняя ингаляционная токсичность (СК /4 часа) для крыс > 2 50 мг/л воды. Возможно проявление отрицательных побочных эффектов. Класс токсичности по ЕПА — IV, ВОЗ — III.

Гигиенические нормативы для беномила в России:

МДУ в винограде — содержание остаточных количеств не допускается. Область применения препарата. Беномил — фунгицид системного действия с длительным защитным эффектом, эффективно подавляет развитие широкого круга заболеваний растений, вызываемых грибами из классов аскомицетов, базидомицетов и несовершенных грибов на зерновых и овощных культурах, сахарной свекле, виноградниках, в садах, при обработке семян.

1.2 Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.

Торговое наименование: Колфуго Супер.

Действующее вещество: карбендазим.

Структурная формула: (не приводится).

Метилбензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).

Брутто-формула: C H № O . 9 9 3 2

Мол. масса: 191,3.

Белые кристаллы. Температура плавления: более 302 — 307 °С, возгоняется с разложением, начиная с 230 °С. Давление паров при 20 °С: 0,09 мПа.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: K log P = 1,38 (pH 5), ow 1,51 (pH 7), 1,49 (pH 9) (25 °С).

Растворимость (г/л) при 24 °С: ацетон — 0,3, диметилформамид — 5, этанол — 0,3, этилацетат — 0,135, хлороформ — 0,1, гексан — 0,00005.

Растворимость в воде при 24 °С: 29 мг/л (при pH 4), 8 мг/л (при pH 7), 7 мг/л (при pH 9).

    Стабилен   не  менее  2  лет  при  температуре  ниже  50  °С,  медленно
разлагается  в  щелочных  растворах  (DT    >  124  дня  при 22 °С и pH 9),

                                    50

стабилен в кислотах в виде водного раствора соли (DT > 350 дней при pH 5 50

• 7).

    Краткая    токсикологическая    характеристика.    Острая   пероральная
токсичность  (LD  )  для  крыс  -  более  15000  мг/кг;  острая  дермальная

            50

токсичность (LD ) для кроликов — более 10000 мг/кг, не ирритант для 50 кроликов; острая ингаляционная токсичность (LC /4 часа) для крыс, кроликов 50

• 10 г/л воды. Нетоксичен для пчел: LD > 50 мкг/особь. Класс токсичности 50 по ЕПА — IV, ВОЗ — III.

Гигиенические нормативы для карбендазима в России:

МДУ в винограде — содержание остаточных количеств не допускается.

Область применения препарата. Карбендазим — фунгицид широкого спектра действия с защитными и целебными свойствами, применяется для борьбы против септориоза, фузариоза, головневых болезней и др. на зерновых культурах, против различных заболеваний плодово-овощных культур, используется для обработки семян перед посевом.

2. Методика определения остаточных количеств беномила по карбендазиму и карбендазима в ягодах винограда и виноградном соке методом ВЭЖХ

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении беномила по карбендазиму и карбендазима методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после извлечения карбендазима из образцов раствором соляной кислоты и очистки путем перераспределения между двумя жидкими фазами.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Объект анализа	Предел обнаружения мг/кг	Диапазон определяемых концентраций мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта n = 24)	Относительное стандартное отклонение S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0,95
Беномил
Ягоды	0,015	0,015 — 0,15	80,8	8,60	7,10
Сок	0,015	0,01 — 0,15	90,1	2,19	2,32
Карбендазим
Ягоды	0,01	0,01 — 0,1	81,9	7,60	6,08
Сок	0,01	0,01 — 0,1	94,0	2,90	2,50

Среда	Внесено, мг/кг (мг/л)	Найдено, мг/кг (мг/л)	Стандартное отклонение, S, +/-	Полнота определения, %
1	2	3	4	5
Ягоды	0,01	0,00811	-4 6,93 х 10	81,1
	0,02	0,01654	-3 1,58 х 10	82,7
	0,05	0,04091	-3 3,53 х 10	81,8
	0,1	0,08203	-3 8,87 х 10	82,0
Среднее				81,9
Сок	0,01	0,00952	-3 4,28 х 10	95,2
	0,02	0,01926	-3 7,43 х 10	96,3
	0,05	0,04786	-2 2,23 х 10	95,7
	0,1	0,08890	-2 3,53 х 10	88,9
Среднее				94,0

2.1.3 Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетонитрил для ВЭЖХ, «В-230НМ» или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.

Бумажные фильтры «синяя лента», ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Карбендазим, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,5%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — 0,1М ортофосфорная кислота (10:90, по объему).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Этилацетат, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором и термостатом колонки, или аналогичный.

Колонка RES ELUT — РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-73.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42-861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы ягод винограда хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы сока хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 3 суток, при температуре -18 °С — в течение месяца (в пластиковых бутылях).

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку RES ELUT — РН 90А кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 — 2 часов.

2.5.3 Приготовление растворов

Для приготовления подвижной фазы смешивают 100 мл ацетонитрила с 900 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют.

2.5.4 Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску карбендазима (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы — в течение суток.

При определении полноты извлечения беномила и карбендазима из винограда для внесения в контрольный образец используют стандартный раствор, разбавленный ацетонитрилом до требуемой концентрации методом последовательного разбавления.

2.5.5 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбендазима в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6 Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1 Определение карбендазима в соке

Образец предварительно отфильтрованного на воронке Бюхнера через фильтр «синяя лента» сока объемом 20 мл количественно переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, добавляют 80 мл 0,1М HCl. Далее очистку проводят по п. 2.6.3.

2.6.2 Определение карбендазима в ягодах винограда

Навеску ягод винограда массой 100 г гомогенизируют в гомогенизаторе, помещают в плоскодонную колбу объемом 1 л, приливают 500 мл 0,1М HCl и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Экстракцию повторяют еще дважды. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 20 г ягод, экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр «красная лента». Далее очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

2.6.3 Очистка экстрактов

Полученные экстракты промывают в делительной воронке объемом 250 мл дважды гексаном порциями по 50 мл (верхний гексановый слой отбрасывают) и дважды этилацетатом порциями по 20 мл (верхний этилацетатный слой отбрасывают), встряхивая каждый раз воронку в течение 3 — 5 минут. К солянокислому раствору добавляют 0,1М NaOH до pH 10 — 11 (контроль осуществляют pH-метром) и экстрагируют карбендазим этилацетатом трижды порциями по 50 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 — 15 мл этилацетата. Полученный раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Альянс» фирмы «Waters» с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка RES ELUT — РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).

Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (20 х 3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил — 0,1М ортофосфорная кислота в соотношении 10:90 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 280 нм.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Время удерживания карбендазима 9,2 +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 — 1,00 мкг/мл.

2.6.5 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание беномила по карбендазиму и карбендазима в образцах винограда или виноградного сока (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

                            S  х С х V
                             2

Х = ---------- х К, S х Р 1

где:
S  - площадь пика карбендазима в стандартном растворе, ед. адс. хс;
 1
S  - площадь пика карбендазима в анализируемой пробе, ед. адс. хс;
 2
V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, мл;
Р - навеска анализируемого образца, г (для сока - объем, мл);
С - концентрация стандартного раствора карбендазима, мкг/мл.

    К  -  коэффициент, учитывающий соотношение молекулярных масс беномила и
карбендазима,  К  =  1  при  расчете  содержания  карбендазима, К = 1,5 при

расчете беномила.

Содержание остаточных количеств карбендазима в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбендазима 2 мкг/мл, разбавляют.

3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

5. Разработчики

ВИЗР, Санкт-Петербург.

---