МУК 4.1.1814-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств флуазинама в воде, почве, картофеле газохроматографическим методом
(утв. Минздравом России 18.12.2003)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299). Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32). Документ введен в действие с 1 апреля 2004 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
18 декабря 2003 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУАЗИНАМА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, КАРТОФЕЛЕ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
1 апреля 2004 года
1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (проф. Т.В. Юдина), Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (гл. специалист А.П. Веселов), под редакцией член-корр. РАМН В.В. Ракитского.
2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. № 20 от 2 декабря 2003 г.).
3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 18 декабря 2003 г.
1. Вводная часть
Фирма-производитель: ИСК Биосайенсис (Бельгия).
Действующее вещество: флуазинам.
3-хлор-N-(3-хлор-5-трифторметил-2-пиридил)-альфа,альфа,альфа-трифтор-2,6-динитро-р-толуидин (ИЮПАК).
3-хлор-N-[3-хлор-2,6-динитро-4-(трифторметил)фенил]-5-(трифторметил)-2-пиридинамин (С.А).
Структурная формула (не приводится).
Эмпирическая формула: C H Cl F N O . 13 4 2 6 4 4
Светло-желтое кристаллическое вещество.
Температура плавления: 115 — 117 °С.
Давление паров при 25 °С: 1,5 мПа.
Коэффициент распределения н-октанол/вода: К log P = 3,56. ow
Растворимость (в г/л растворителя) при 20 °С: гексан — 12, ацетон — 470, толуол — 410, диэтиловый эфир — 320, дихлорметан — 330, этанол — 150; растворимость в воде — 1,7 мг/л.
Вещество стабильно в кислотах, щелочах и при нагревании.
В почве разрушается медленно: ДТ = 33 — 62 дня. 50
Краткая токсикологическая характеристика:
Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс > 5000 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для крыс > 2000 мг/кг; острая 50 ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — 0,463 мг/куб. дм 50
воздуха. Флуазинам оказывает раздражающее действие на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенным и тератогенным эффектами. Для птиц, пчел, рыб, дождевых червей и
дафний малотоксичен.
Гигиенические нормативы в России не установлены.
Флуазинам — фунгицид защитного действия из группы разобщителей окислительного фосфорилирования. Обладает слабой системной активностью. Эффективен против возбудителей серой гнили и мильдью на винограде, парши на яблоне, южной склероциальной гнили на арахисе, фитофтороза и альтернариоза на картофеле, килы на крестоцветных.
Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Ширлан, СК (500 г флуазинама в 1 л препарата) в качестве средства борьбы с возбудителями фитофтороза и альтернариоза картофеля с нормой расхода препарата 0,4 л/га и четырехкратной обработкой за сезон.
2. Методика определения остаточных количеств флуазинама в воде, почве, картофеле газохроматографическим методом
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод основан на газохроматографическом определении флуазинама с ДЭЗ на неподвижной фазе OV-225 после экстракции его из подкисленной воды гексаном, из почвы подкисленным водным метанолом, из клубней картофеля подкисленным метанолом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем.
Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.
2.1.2 Избирательность метода
В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания картофеля.
2.1.3 Метрологическая характеристика метода
| Анализируемый объект | Предел обнаружения, мг/куб. дм, мг/кг | Диапазон определяемых концентраций, мг/куб. дм, мг/кг | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, S | Относительное отклонение, DS, % | Доверительный интервал среднего, % |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Вода | 0,001 | 0,001 — 0,01 | 93,3 | 3,5 | 1,6 | +/- 3,3 |
| Почва | 0,02 | 0,02 — 0,2 | 90,1 | 3,6 | 1,6 | +/- 3,4 |
| Клубни картофеля | 0,025 | 0,025 — 0,25 | 84,8 | 3,7 | 1,7 | +/- 3,5 |
2.2. Реактивы, растворы и материалы
Флуазинам с содержанием д.в. 99,7%.
Вода дистиллированная или деионизованная, ГОСТ 7602-72.
н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.
Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.
Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.
Кислота уксусная ледяная, ч.д.а., ГОСТ 61-75.
Кислота хлороводородная х.ч., ГОСТ 3118-77.
Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.
Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.
Натрий двууглекислый, хч., ГОСТ 83-79.
Спирт метиловый, ГОСТ 6995-77.
Этилацетат, ГОСТ 22300-76.
Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан — этилацетат (8:2, по объему).
Азот газообразный, осч, ГОСТ 9293-74.
Силикагель для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) 1 степени активности или силикагель КСК (60 — 100 меш).
Целит 535 (2 — 15 мкм) (Серва, Германия).
Фильтры бумажные «синяя лента», ТУ 6-09-1678-77.
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Хроматограф газовый Тракор (США), мод. 570 с ДЭЗ или аналогичный.
Колонка хроматографическая 2000 х 2 мм, неподвижная фаза 3% OV-225 на Хромосорбе W(НР), размер частиц 0,125 — 0,150 мм.
Колонка хроматографическая 1000 х 2 мм, неподвижная фаза 3% ХЕ-60 на Супелкопорт, размер частиц 0,16 — 0,20 мм.
Колонка капиллярная для ГЖХ ZB-1, длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex, США, или аналогичная.
Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф по ТУ 64-1-2850.
Аппарат для встряхивания АВУ, ТУ 64-1-1081-83.
Баня ультразвуковая, модель D-50, Branson Instr. Co., США, или аналогичная.
Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.
Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.
Иономер ЭВ-74, ГОСТ 22261-76, или аналогичный.
Прибор для перегонки при атмосферном давлении.
Ротационный испаритель, тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.
Сито с диаметром отверстий 1 мм.
Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147-73.
Воронки делительные вместимостью 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.
Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.
Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.
Колбы мерные вместимостью 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.
Колбы грушевидные вместимостью 50, 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.
Пипетки мерные вместимостью 1, 2 и 5 мл, ГОСТ 20292-74Е.
Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 мл, ГОСТ 10515-75.
Стаканы стеклянные емкостью 400 мл, ГОСТ 6236-72.
Цилиндры мерные вместимостью 50, 100 и 250 мл, ГОСТ 1770-74.
2.4. Отбор проб
Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).
Пробы клубней картофеля хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение суток; для длительного хранения пробы замораживаются и хранятся при температуре -18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 2 дней, при температуре -18 °С в течение месяца.
Пробы почвы высушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния и хранят в стеклянной емкости не более трех месяцев.
Перед анализом клубни картофеля измельчают на терке, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.
2.5. Подготовка к определению
2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей
Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.
Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.
2.5.2 Подготовка и кондиционирование колонки
Готовую насадку (3% OV-225 на Хромосорбе W(НР)) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8 — 10 часов.
2.5.3 Приготовление стандартных растворов
Основной стандартный раствор флуазинама с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,7% д.в., в гексане в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.
Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора флуазинама соответствующим последовательным разбавлением гексаном. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более 15 дней.
При изучении полноты открывания флуазинама в модельных матрицах используются метанольные растворы вещества.
2.5.4 Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора флуазинама с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации флуазинама в растворе в мкг/мл.
2.5.5 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта
В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,2 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают около 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него 2 г безводного сульфата натрия. Колонку промывают 30 мл смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему) и затем 20 мл гексана со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.
2.5.6 Проверка хроматографического поведения флуазинама на колонке с силикагелем
В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора флуазинама с концентрацией 100 мкг/мл, отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл гексана и наносят на подготовленную колонку. Промывают колонку 50 мл гексана и смывы отбрасывают. После этого через колонку пропускают 50 мл элюента № 1 (смесь гексан — этилацетат, 8:2) со скоростью 1 — 2 капли в секунду и отбирают фракции по 5 мл каждая. Собранные фракции упаривают досуха, остаток растворяют в 1 мл гексана и анализируют на содержание флуазинама по п. 2.7.1. Фракции, содержащие флуазинам, объединяют, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 20 мл гексана и вводят в хроматограф 2 мкл пробы. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту вымывания из колонки и необходимый для очистки объем элюента.
Примечание: Профиль вымывания флуазинама может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.
2.6. Описание определения
2.6.1 Экстракция флуазинама
2.6.1.1. Вода. 100 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 250 мл, подкисляют конц. HCl до рН 1 и обрабатывают 30 мл гексана при встряхивании в течение 1 минуты. Верхний органический слой отделяют и водную фазу экстрагируют гексаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Остаток растворяют в 1 мл гексана и анализируют на содержание флуазинама по п. 2.7.1.
2.6.1.2. Почва. Навеску (25 г) воздушно-сухой почвы переносят в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 2 мл ледяной уксусной кислоты, 125 мл смеси метанол — вода (2:1, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 5 минут. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Почву повторно экстрагируют 50 мл смеси метанол — вода (2:1) в ультразвуковой бане в течение 3 минут и суспензию фильтруют. Остаток на фильтре промывают 20 мл смеси метанол — вода (2:1). Объединенный фильтрат доводят смесью метанол — вода (2:1) до объема 200 мл и отбирают аликвоту раствора (40 мл), эквивалентную 5 г почвы. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.
2.6.1.3. Клубни картофеля. К навеске (20 г) натертых на мелкой терке клубней картофеля прибавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл метанола и перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. К суспензии прибавляют 2 г целита 535 и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Растительный остаток промывают на фильтре 80 мл метанола. Объединенный экстракт доводят метанолом до объема 200 мл и отбирают аликвоту раствора (50 мл), эквивалентную 5 г растительной ткани. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.
2.6.2 Очистка экстрактов
Аликвоту почвенного экстракта из пп. 2.6.1.2 переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, добавляют 80 мл 0,2 н HCl и 50 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. и после ее расслоения отделяют гексановый слой, который пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия. Водную фракцию экстрагируют гексаном еще два раза (20 + 20 мл). Объединенный гексановый экстракт упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С.
Аликвоту растительного экстракта из п. 2.6.1.3 переносят в делительную воронку емкостью 500 мл, добавляют 150 мл 0,2 н HCl и 50 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. и после разделения фаз верхний гексановый слой сливают в колбу. Экстракцию повторяют еще два раза, используя 20 мл гексана каждый раз. Объединенный гексановый экстракт переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, приливают 80 мл 0,5 н NaOH и встряхивают ее содержимое в течение 1 — 2 минут. После разделения фаз нижний водный слой сливают в стакан, а гексановую фракцию повторно экстрагируют 80 мл 0,5 н NaOH. Объединенную водную фазу подкисляют конц. HCl до рН 1 (контролируя с помощью иономера) и переносят в делительную воронку емкостью 500 мл, приливают 50 мл гексана и встряхивают ее содержимое в течение 1 — 2 минут. После разделения фаз сливают гексановую фракцию в концентратор через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию водной фазы гексаном повторяют еще два раза (по 20 мл). Объединенный гексановый экстракт упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С.
2.6.3 Очистка на колонке с силикагелем
Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала и почвы, количественно переносят двумя 2 мл порциями гексана в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5) и дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 40 мл гексана, которые отбрасывают. Флуазинам элюируют 35 мл элюента № 1 (гексан — этилацетат, 8:2), собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток экстракта почвы и клубней картофеля растворяют соответственно в 1,25 и 1 мл гексана и анализируют по п. 2.7.1.
2.7. Условия хроматографирования
2.7.1 Метод ГЖХ с насадочными колонками
Газовый хроматограф Тракор (США), мод. 570 с детектором по 63 захвату электронов (Ni ). -9
Показания электрометра — 1 х 10 А.
Скорость движения ленты самописца — 15 см/час.
Колонка стеклянная спиральная 2000 х 2 мм; неподвижная фаза — 3% OV-225 на Хромосорбе W(НР) (0,125 — 0,150 мм).
Температура детектора 350 °С, инжектора 250 °С, термостата колонки 230 °С.
Скорость потока газа-носителя (азота) — 30 мл/мин.
Время удерживания флуазинама — 3 мин. 40 сек.
Предел детектирования — 0,2 нг.
Линейный диапазон детектирования — 0,2 — 2,0 нг.
Альтернативная фаза: 3% ХЕ-60 на Супелкопорт (0,16 — 0,20 мм); колонка стеклянная 1000 х 2 мм; температура колонки — 220 °С, испарителя — 250 °С, детектора — 350 °С.
Время удерживания флуазинама — около 3 мин.
Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/мл, разбавляют гексаном.
2.7.2 Метод ГЖХ с капиллярными колонками
Хроматограф «Кристалл 2000М» с электронозахватным детектором с -15 пределом детектирования по Линдану не выше 8,2 х 10 г/куб. см.
Колонка капиллярная кварцевая ZB-1, 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм.
Температура термостата колонки — 240 °С, термостата испарителя — 250 °С, детектора — 350 °С.
Газовый режим: газ-носитель — азот, общий расход — 22,9 мл/мин.; газ для поддува в детектор — азот, расход — 20 мл/мин.
Абсолютное время удерживания флуазинама: 6 мин. 19 сек. — 6 мин. 23 сек.
Линейный диапазон детектирования: 0,02 — 0,5 нг.
Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.
Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,25 мкг/мл, разбавляют.
2.8. Обработка результатов анализа
Содержание флуазинама рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:
Н х А х V
1
где:
Х - содержание флуазинама в пробе, мг/куб. дм или мг/кг;
Н - высота пика стандарта, мм;
0
Н - высота пика образца, мм;
1
А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,
мл; m — масса анализируемого образца или его части, г (для почвы и клубней картофеля 5 г).
3. Требования техники безопасности
Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.
4. Контроль погрешности измерений
Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.
5. Разработчики
Дубовая Л.В., науч. сотр.; Талалакина Т.Н., науч. сотр.; Макеев А.М., зав. лабораторией, канд. биол. наук.
ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.