МУК 4.1.1795Б-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение аверсектина С (по авермектину В1А) в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Минздравом России 11.12.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АВЕРСЕКТИНА С (ПО АВЕРМЕКТИНУ В1а) В ПОЧВЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Подготовлены Российским государственным медицинским университетом (Е.Б. Гугля).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 11 декабря 2003 г. и введены в действие с 1 марта 2004 г.

3. Введены впервые.

    Настоящие   методические   указания   устанавливают   методику
количественного  химического анализа почвы для  определения  в ней
авермектина  В   (10Е,14Т,16Е,2Z)-(1R,4S,S',6S,6'R,8R,12S,20R,21R,

          1а

24S)-6'-[(S)]-sec-бутил]-21,24-гидрокси-S',11,13,22-тетраметил-2- оксо-3,7,19-триоксатетрацикло=[16,61]-4,8О,22,24-пентакоза-0,14, 16,22-тетраен-6-спиро-2'(5',6'-дигидро-2Н-пиран)-12-ил-2,6- дидеокси-4-2-(2,60-дидеокси-3-0-метил-альфа-1-арабино=

гексапиранозил)-3=0-метил-альфа-арабиногекса-пиранозида)         в
диапазоне     концентраций    0,05    -    1,0    мг/кг    методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Структурная формула (не приводится).

Авермектин В — один из восьми компонентов аверсектина С, 1а противопаразитарного препарата, представляющего собой смесь близких в химическом отношении авермектинов — природных 16-членных

макроциклических  лактонов,  продуктов  жизнедеятельности культуры
Streptomycis  avermitilis  (табл.  1).  Компоненты  А   и В  имеют
                                                     1     1

двойную связь в положении 22 — 23 (см. рисунок — не приводится), у

компонентов А  и В  эта связь восстановлена. Содержание компонента
             2    2

1а

Таблица 1

СТРОЕНИЕ АВЕРМЕКТИНОВ

Регистрационный номер по САS 73989-17-0.

Аверсектин С — порошок белого или желтовато-белого цвета, легко растворим в хлорированных углеводородах, ацетоне, бензоле, растворим в низших спиртах, практически не растворим в воде, петролейном эфире. Температуры плавления авермектинов (с разложением) составляют около 150 °С.

    Аверсектин   С   обладает   общетоксическим  действием.  Класс
опасности  -  первый.  Ориентировочный  допустимый  уровень  (ОДУ)

                           1а

1. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 23%, при доверительной вероятности 0,95.

2. Метод измерений

Для измерения массовой концентрации авермектина В проводят 1а экстракцию вещества из пробы почвы этилацетатом и подготавливают пробу путем осушивания, фильтрации, промывания экстракта гексаном,

двукратного   упаривания   с   растворением   сухого   остатка   в
ацетонитриле  и  очистки  на  патронах  Диапак  С16  и  Диапак NН.
Количественное определение  авермектина В   ,одного из компонентов

                                     1а

аверсектина      С,     проводят     методом     обращенно-фазовой
высокоэффективной    жидкостной    хроматографии   с   применением

флуоресцентного детектора при длинах волн возбуждения и испускания

365    и    470    нм   соответственно,   предварительно   получая
флуоресцирующие  производные  авермектинов  путем их дериватизации

1-метилимидазолом и трифторуксусным ангидридом.

Нижний предел измерения авермектина В в объеме элюируемой

                                        1а<br>

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

3.1 Средства измерений

Хроматограф жидкостный с флуоресцентным детектором (Du Pont 8800, США)

Компьютерная программа Мультихром 1.5х

Весы аналитические                                 ГОСТ 24104-88Е
Меры массы                                         ГОСТ 7328-82Е
Автоматические пипетки ГН                          ТУ 64-1-3329-81

Колбы мерные вместимостью 25, 100 и 250 куб. см ГОСТ 1770-74Е

Цилиндр мерный вместимостью 500 куб. см ГОСТ 1770-74Е.

3.2 Вспомогательные устройства

Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм и внутренним диаметром 4 мм, заполненная

Диапак NН (БиоХимМак, Россия)

Набор для фильтрации жидкостей (НПФ Биохром, Россия)

Бюксы 50/30 ГОСТ 25336-82Е

Колбы круглодонные вместимостью ГОСТ 25336-82 50 куб. см

Воронка фильтровальная ВФ-20/16 ГОСТ 25336-82

Воронка делительная ГОСТ 25336-82

Центрифуга низкоскоростная ЦЛК-1 ТУ 375-4166

Центрифужные пробирки стеклянные вместимостью ГОСТ 17700-74 5 куб. см с полиэтиленовыми пробками

Ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М

Морозильная камера или холодильник ГОСТ 26678-85

Вакуумный испаритель ротационный ИР-1М ТУ 25-11-917-76

Лопата ГОСТ 19596-87

Бур ГОСТ 17016-71

Набор сит ГОСТ 6613-86

Пакеты полиэтиленовые из светозащитной пленки ГОСТ 12302-83 Фарфоровые ступка и пестик ГОСТ 9147-80Е.

3.3 Материалы

Фильтры бумажные «синяя лента» ТУ 6-09-1678-95.

3.4 Реактивы

Авермектин В , содержание авермектина РСО 9340-201-00-94189-99

        1<br>

1а

Аверсектин С, содержание авермектина      ТУ 9383-009-17266133-97

В   не менее 40%

Этилацетат, хч ГОСТ 2230-76

Натрия сульфат безводный, хч ГОСТ 4166-76

1-Метилимидазол импортный (Меrk, Германия)

Трифторуксусный ангидрид импортный (Меrk, Германия)

Гексан, чда ТУ 2631-003-05807999-98

Спирт метиловый, хч ГОСТ 6995-77

Ацетонитрил «для жидкостной ТУ 6-09-14-2167-84 хроматографии»

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.

Допускается применение иных средств измерения, вспомогательных устройств, реактивов и материалов, обеспечивающих показатели точности, установленные для данных методических указаний.

4. Требования безопасности

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1005-88.

При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-76.

При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы на жидкостном хроматографе.

6. Условия измерений

Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 84 — 106 кПа и влажности воздуха не более 80%.

7. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений проводят приготовление растворов, подготовку прибора, установление градуировочной характеристики, подготовку концентрирующих патронов, отбор проб.

7.1 Приготовление растворов

Стандартный раствор № 1 авермектина В для градуировки.

                                          1

Раствор авермектина В с концентрацией 100 мкг/куб. см готовят 1 путем растворения 25 мг авермектина В в ацетонитриле в колбе

                                      1

вместимостью 250 куб. см. Раствор хранят не более 2 месяцев в холодильнике.

Стандартный раствор № 2 авермектина В с концентрацией 1

авермектина  В   0,889 мкг/куб. см (авермектина В  10 мкг/куб. см)
              1а                                 1
готовят  путем  разведения  1  куб. см стандартного раствора N 1 в
колбе  вместимостью  100  куб. см ацетонитрилом. Раствор хранят не

более 2 недель в холодильнике.

Градуировочные растворы готовят разбавлением стандартного раствора № 2 в мерных колбах объемом 25 куб. см согласно табл. 2. Вносят пипеткой рабочий раствор в мерные колбы вместимостью 25 куб. см в соответствии с табл. 2, доводят уровень ацетонитрилом до метки и перемешивают. Градуировочные растворы устойчивы в течение недели при хранении в холодильнике.

Таблица 2

ГРАДУИРОВОЧНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КОНЦЕНТРАЦИИ АВЕРМЕКТИНА В В ПОЧВЕ 1а

Реакционную смесь готовят из трифторуксусного ангидрида и ацетонитрила в соотношении 1:2. Смесь готовят в день работы, помещают в холодильник при 0 °С и не хранят.

Раствор элюента готовят смешиванием в мерном цилиндре 490 куб. см метилового спирта и 10 куб. см воды. Непосредственно перед измерением раствор фильтруют с помощью набора для фильтрации.

7.2 Подготовка прибора

Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.

7.3 Установление градуировочной характеристики

    Градуировочную  характеристику, выражающую зависимость площади
пика  авермектина  В    (в  условных единицах) от количества массы

                1а

(мкг) авермектина В в хроматографируемом объеме пробы,

                   1а

устанавливают  по  методу  абсолютной градуировки с использованием
градуировочных растворов авермектина В  .

                                  1а

Для построения градуировочной характеристики отбирают по 2,0 куб. см каждого градуировочного раствора, помещают в центрифужные пробирки и упаривают досуха на вакуумном испарителе. В каждую пробирку с сухим остатком вносят по 0,5 куб. см ацетонитрила, пробирку энергично встряхивают и обрабатывают ультразвуком в течение 30 с. Затем пробирку повторно встряхивают и повторно обрабатывают ультразвуком. В каждую пробирку вносят по 0,05 куб. см 1-метилимидазола. Пробирку закрывают, тщательно перемешивают содержимое в течение 5 — 10 с, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и помещают в холодильник при 0 °С на 10 минут. После охлаждения в пробирку с образцом вносят 0,15 куб. см охлажденной реакционной смеси. Пробирку закрывают и выдерживают в холодильнике в течение 1 часа. Общий объем раствора пробы после проведения реакции — 0,7 куб. см.

Растворы помещают в пробоотборное устройство хроматографа. Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

состав элюента: метиловый спирт — вода, 98:2

    скорость потока элюента                      2,0 куб. см/мин.
    объем вводимой пробы                         20 куб. мм
    длины волн флуоресцентного детектора         365/470 нм

время удерживания авермектина:

В 9,7 мин. 1в

В 12,2 мин. 1а

Измеряют площади пика авермектина В с помощью компьютерной 1а

программы  (в  условных  единицах)  при анализе 6 растворов разных
концентраций,  проводя  не  менее  5  параллельных определений для

каждого раствора, и строят градуировочную характеристику.

Проверку градуировочной характеристики проводят при изменении условий анализа, но не реже 1 раза в неделю.

7.4 Отбор проб

Пробы почвы отбирают с 2 — 3 площадок размером 25 кв. м каждая. С каждой площадки отбирают смешанный образец почвы, состоящий из 5 проб, взятых по методу конверта (по углам и в центре). Пробы отбирают лопатой на глубину пахотного слоя 20 — 25 см или, при изучении распространения химических загрязнений в глубину, буром на уровнях 0,25 — 0,5 — 0,75 и так до 2 м. Почву обрезают лопатой в виде прямоугольной пластины и следят за тем, чтобы в каждый образец попало примерно равное количество почвы верхнего и нижнего слоев. Отобранные пробы помещают в полиэтиленовые мешочки. Пробы пронумеровывают, на схематическом чертеже изучаемой территории делают соответствующие обозначения. Отобранные пробы следует защищать от нагрева и освещения солнечными лучами и срочно направлять в лабораторию с сопроводительным бланком.

Поступившие в лабораторию образцы почвы из одного изучаемого участка взвешивают, затем тщательно перемешивают все вместе и освобождают от посторонних примесей (камни, шлак, растения и т.д.). После перемешивания почву пропускают через сито с отверстиями 3 мм. Из общей массы методом квартования (деления на 4 части и отбора одной или двух противоположных частей) берут 1,0 — 1,5 кг почвы для исследования.

7.5 Подготовка патронов

Непосредственно перед проведением измерения активируют патроны, для чего снимают заглушки с патронов; через патрон Диапак С16 пропускают последовательно 5 куб. см ацетонитрила и 5 куб. см воды, через патрон Диапак СN — 5 куб. см ацетонитрила.

8. Выполнение измерений

Приготовленные соответствующим образом образцы почвы высушивают до воздушно-сухого состояния при комнатной температуре, просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм, после чего растирают в ступке до состояния пудры. Навеску массой 2 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 100 куб. см, заливают 20 куб. см этилацетата и оставляют на сутки или же встряхивают колбу в течение часа. Экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия и фильтровальную бумагу в колбу емкостью 50 куб. см. Пробу почвы повторно экстрагируют таким же способом, экстракты объединяют. Отбирают с помощью мерного цилиндра 28 куб. см экстракта, переносят в круглодонную колбу емкостью 50 куб. см и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила и переносят в делительную воронку. Экстракт промывают 5 раз порциями гексана по 10 куб. см. Гексановые фракции отбрасывают.

Ацетонитрильную фракцию упаривают и снова растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и добавляют к этому раствору 10 куб. см дистиллированной воды. Раствор пропускают через предварительно активированный патрон Диапак С16. Сорбированную пробу элюируют с патрона Диапак С16 20 куб. см ацетонитрила через присоединенный патрон Диапак NН. Элюат собирают в пробирку и упаривают досуха. Проводят дериватизацию аналогично тому, как описано в п. 7.3 для градуировочных растворов.

компонента В в растворе проводят по предварительно построенной 1а градуировочной характеристике.

9. Вычисление результатов измерений

Концентрацию авермектина В «С» (мг/кг) в почве вычисляют по 1а формуле:

                          а х в х г

С = ---------, б х М х д

где:

а — содержание вещества в хроматографируемом объеме пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

б — объем пробы, взятой для хроматографирования, куб. см;

в — общий объем раствора пробы после проведения химической реакции, куб. см;

г — объем растворителя при экстракции из почвы, куб. см;

д — объем экстракта, отобранного для упаривания, куб. см;

М — навеска пробы почвы, подготовленная для анализа, г.

Концентрацию аверсектина С «С » (мг/кг) в почве вычисляют 1 по формуле:

                              С

                             С  = -,
                              1   К

где:
С - концентрация авермектина В  , мг/куб. м;
                              1а
К  - массовая доля авермектина В   в  аверсектине  С  согласно
                                1а

ТУ 9383-009-17266133-97.

10. Оформление результатов измерений

Протокол N _____ количественного химического анализа аверсектина в почве

2. Место отбора пробы ____________________________________________

3. Название лаборатории __________________________________________

4. Юридический адрес лаборатории _________________________________

Результаты химического анализа

Ответственный исполнитель:

Научный руководитель:

11. Контроль погрешности измерений

11.1 Метрологическая аттестация методики

Метрологическую аттестацию проводят в соответствии с ГОСТ Р 8.563-96, МИ 2336-95 и МИ 2335-95. Значения характеристики погрешности, норматива оперативного контроля погрешности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в табл. 3 в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе С. Концентрацию определяют как среднеарифметическое результатов параллельных определений.

11.2 Оперативный контроль воспроизводимости

Оперативный контроль воспроизводимости выполняют в одной серии

с  анализом  рабочих  проб.  Отбирают  две реальные пробы почвы из
одного  традиционного  места  отбора  одновременно.  Анализируют в
соответствии  с  прописью  методики,  максимально варьируя условия

проведения анализа: партии реактивов, наборы мерной посуды и т.д.,

и  получают два результата С  и С  анализов. Результаты анализа не
                            1    2
должны  отличаться друг от друга на величину большую, чем норматив

оперативного контроля воспроизводимости D:

                        1    2

При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Внутренний оперативный контроль воспроизводимости проводят не реже чем 1 раз в месяц.

11.3 Оперативный контроль точности

    Оперативный  контроль  точности  выполняют  в  одной  серии  с
анализом  рабочих  проб.  Отбирают  реальные пробы почвы из одного
традиционного  места  отбора  одновременно. Подготавливают пробы в
соответствии  с  методикой.  Перед этапом экстракции к одной пробе
делают  добавку  анализируемого  компонента  дельта С из раствора.
Величина  добавки  должна  соответствовать 50 - 150% от содержания
компонента  в  пробе.  Результаты  анализа  С   без добавки и С  с
                                             1                 2
добавкой  получают  по  возможности  в  одинаковых условиях: одним
аналитиком,  с  одной  партией реактивов, с одним набором посуды и
т.д.  Решение  об  удовлетворительной  погрешности  принимают  при

выполнении условия:

                   2    1

Внутренний оперативный контроль точности проводят не реже чем 1 раз в месяц.

Методические указания разработаны: ООО НБЦ «Фармбиомед» (В.Т. Тер-Симонян, Е.Б. Кругляк), Российский государственный медицинский университет (Е.Б. Гугля).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Diserens Н., Henzelin М. //Journal of Chromatography А., 1999. V. 833. № 1. Р. 13 — 18.

2. Руководство по контролю загрязнения атмосферы. РД 52.04.186-96. М., 1991, 693 с.

3. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Atlanta, 1989 and 1990, 184 с.

4. Дмитриев М.Т., Казнина Н.И., Пинигина И.А. Санитарно-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей среде. Справ, изд. М.: Химия, 1989, 368 с.