МУК 4.1.1483-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой. Методические указания

(утв. Минздравом России 29.06.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ХИМИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ В ДИАГНОСТИРУЕМЫХ БИОСУБСТРАТАХ, ПРЕПАРАТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С ИНДУКТИВНО СВЯЗАННОЙ АРГОНОВОЙ ПЛАЗМОЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Настоящие Методические указания устанавливают методику количественного определения методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) элементов (серебра, алюминия, мышьяка, золота, бария, бериллия, висмута, бора, кальция, кадмия, кобальта, хрома, меди, железа, галлия, германия, ртути, калия, лития, магния, марганца, молибдена, натрия, никеля, свинца, платины, рубидия, фосфора, сурьмы, селена, олова, стронция, титана, таллия, ванадия, вольфрама, цинка, циркония) в диагностируемых биосубстратах: волосы, ногти, кровь, плазма, грудное молоко, моча, аутопсийные материалы (печень, почки, миокард, плацента), слюна, зубы и в препаратах аминокислот, поливитаминных препаратах с микроэлементами, биологически активных добавках к пище и в сырье для их изготовления.

1. Погрешность измерений

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в Прилож. 1.

2. Сущность метода

    Метод ИСП-МС  комбинирует  использование  индуктивно связанной
плазмы   в    качестве    источника    ионов    с    квадрупольным

масс-спектрометром, выступающим в роли масс-анализатора (фильтра),

и  дискретно-динодным   детектором,   который   используется   для
регистрации  отдельных  ионов  и их потоков.  Индуктивно связанная
плазма,  поддерживаемая в специальной горелке, способна эффективно
возбуждать  однозарядные  ионы из атомов вводимого образца.  Далее
ионы  фокусируются  ионно-оптической   системой   (отделяются   от
полиатомных  и  изобарных  ионов в специальных моделях приборов) и
попадают  в  анализатор  масс-спектрометра,  где  разделяются   по
отношению  массы  к  заряду (m / z).  Соответствующий ионный поток
регистрируется детектором.  Через масс-спектрометр в каждый момент
времени пропускаются ионы со строго определенным (m / z),  которые
затем попадают в детектор для  количественной  регистрации.  Число
соударений  за  единицу  времени пропорционально количеству атомов
каждого  определяемого  изотопа  в  исходном   образце.   Линейный
диапазон  зависимости  интенсивности  сигнала  от  концентрации на

современных приборах превышает шесть — восемь десятичных порядков, позволяя в одном цикле сканирования масс-спектра регистрировать и единичные импульсы от малых концентраций, и ионные токи от высоких

концентраций    элементов.    Для   достижения   такого   широкого
динамического диапазона в современных ИСП-МС приборах  применяется
двойная  регистрация  сигналов:  импульсный  режим одного сегмента
детектора используется для подсчета отдельных ионов  и  аналоговый
режим  другого  -  для  регистрации  ионных токов.  Таким образом,
современные  приборы  ИСП-МС  позволяют  определять   концентрации
элементов   и   отдельных   изотопов  на  уровне  от  сотых  долей

                                                  -12

нанограммов до сотен миллиграммов на литр (0,0n x 10 ...n x -2 10 %). Достигаемые пределы обнаружению, высокие чувствительность и избирательность метода ИСП-МС позволяет количественно определять во многих биологических и медицинских объектах и материалах до 40

• 50 элементов в течение 2 — 3 мин. (без учета времени пробоподготовки).

Для подготовки образцов биосубстратов и препаратов аминокислот и биологически активных веществ к анализу методом ИСП-МС допускается использование двух методов разложения: 1) кислотное растворение в открытых сосудах, без полного разрушения органической матрицы; 2) кислотное разложение («мокрое озоление») с использованием систем микроволновой пробоподготовки. Метод открытого разложения характеризуется следующими особенностями:

• высокой производительностью при небольшом расходе реактивов, что привлекательно малой поправкой на холостой опыт;
• способ неприменим для разложения материалов, содержащих много жирового вещества и конкрементов (жировые ткани, новообразования во внутренних органах);
• возможность частичной или иногда полной потери летучих элементов (As, Hg, I, Se);
• органическая матрица, сохраняющаяся в растворах проб, может быть источником серьезных матричных помех при ИСП-МС измерениях, ограничивающих определение и изотопный анализ некоторых элементов (табл. 2).

Метод микроволнового разложения обеспечивает следующие преимущества:

• высокую производительность разложения;
• более полное окисление органической матрицы практически любых биосубстратов;
• существенное уменьшение потерь летучих элементов при разложении.

3. Характеристика масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой

Для измерений используется масс-спектрометр, обладающий следующими характеристиками:

Диапазон сканирования масс, а.е.м.: 2 — 270. -1

Динамический диапазон системы детектирования: 1 x 10 — 1 x 9 0 имп./с.

Диапазон разрешения, а.е.м.: 0,3 — 3,0.

Пределы обнаружения: Be < 3 нг/л, Co < 1 нг/л, In < 0,5 нг/л, U < 0,5 нг/л.

                                           24             115
    Чувствительность (имп./с на 1 мкг/л):    Mg >  4000,     In  >

   238

30000, U > 25000.

Кратковременная стабильность, СКО: < 3%.

Долговременная стабильность, СКО: < 4%.

                        ++   +
    Двузарядные ионы, Ba  /Ba : < 3%.

Оксидные ионы, CeO/Ce: < 3%.

Уровень фона на массе 220: < 25 имп./с.

Стандартное отклонение уровня фона на массе 220: < 5 имп./с.

Для достижения лучших пределов обнаружения до уровня сотых долей (нг/л) и устранения полиатомных наложений, вызванных матрицей образцов и матрицей растворителя, а также газами плазмы (табл. 1), рекомендуется проводить измерения на приборах с динамической реакционной системой (ДРС). Лучшие пределы обнаружения на этих приборах достигаются за счет уменьшения уровня фона и фокусировки ионов в дополнительном газонаполненном квадруполе (ДРС), расположенном перед квадруполем масс-анализатора. Устранение полиатомных и изобарных наложений осуществляется путем удаления мешающих ионов в результате реакций и взаимодействий с молекулами реакционного газа, напускаемого в ячейку (аммиак, метан и др.).

Программное обеспечение масс-спектрометра должно обеспечивать выполнение следующих функций:

• поддержку следующих методов анализа: количественного, полуколичественного (обзорного), методов изотопного отношения и изотопного разбавления;
• проведение автоматических измерений без участия оператора; для проведения автоматических измерений спектрометр должен быть оборудован устройством автоматического пробоотбора;
• автоматизацию процедур калибровки и настройки шкалы масс и рабочих параметров спектрометра;
• статистическую обработку и сохранение результатов в общепринятых форматах;
• возможность повторной обработки данных без проведения дополнительных измерений;
• возможность использования аппарата контроля качества для оперативного автоматического управления ходом измерений в соответствии с заданными критериями качества и расчет статистических параметров качества.

4. Оборудование, материалы, реактивы

Для сведения к минимуму уровня лабораторного фона все операции

по подготовке образцов  к  измерениям  и  сами  измерения  следует
проводить в чистом помещении,  в котором не скапливается пыль. Для
анализа сверхнизких концентраций загрязнения из  окружающей  среды
являются  основным фактором,  ограничивающим пределы обнаружения и
определения  методом  ИСП-МС.  Для   количественного   определения

элементов, распространенных в окружающей среде, как, например, Na,

Mg,  K,  Ca,  Fe и других, на уровне концентраций порядка и ниже 1
мкг/л,   подготовку  образцов  и  измерения  следует  проводить  в
помещениях класса 1000 (< 1000  взвешенных  частиц  на  1  куб.  м

воздуха). Для подготовки образцов необходимо пользоваться сосудами

                                       TM             TM
из     фторопласта     (PTFE,     Viton  ,      Teflon  )      или
перфторалкоксиполимера  (PFA).  Для временного хранения образцов и
рабочих  градуировочных   растворов   настоятельно   рекомендуется
пользоваться   одноразовой   посудой  из  полипропилена  (пробирки

вместимостью 15 — 20 мл для хранения образцов и вместимостью 50 мл с винтовой крышкой для хранения рабочих стандартов).

5. Требования к безопасности проведения работ

При работе с химическими веществами и реактивами необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.4.021. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утвержденные МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981).

Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце рабочего дня после отключения всех приборов проводится влажная уборка рабочих поверхностей.

Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и осуществляется соблюдением "Правил технической эксплуатации электроустановок потребителей", утвержденных Госэнергонадзором 21.12.84.

Безопасность при работе с баллонами с аргоном обеспечивается соблюдением "Правил устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утвержденных Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700), "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН-245-71) и СНиП-74, ГОСТ 12.1.004.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-87. В лаборатории должны находиться средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Требования безопасности должны соответствовать правилам и рекомендациям, изложенным в техническом описании на приборы.

6. Требования к квалификации лиц, работающих на масс-спектрометре

К выполнению измерений на масс-спектрометре допускаются лица, прошедшие обучение навыкам работы на приборе ИСП-МС, подтвержденное аттестатом фирмы - производителя прибора; изучившие техническое описание измерительного прибора и методику выполнения измерений; обученные в соответствии с ГОСТ 12.0.004-79 и имеющие квалификационную группу не ниже 1 согласно "Правилам технической эксплуатации электроустановок потребителей", утвержденным Госэнергонадзором 21.12.84; прошедшие инструктаж по технике безопасности на рабочем месте и ознакомленные с правилами обслуживания спектрометра. Для работы с источниками огнеопасных и токсичных газов допускаются лица, прошедшие соответствующую подготовку.

К проведению пробоподготовки допускаются операторы с квалификацией "Лаборант", имеющие опыт работы в химической лаборатории.

7. Условия выполнения измерений

Выполнение измерений проводят при нормальных климатических условиях испытаний в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.

Температура окружающего воздуха в лаборатории 18 - 25 °С. Атмосферное давление 84 - 106 кПа (630 - 800 мм рт. ст.). Относительная влажность воздуха 75 +/- 5%. Градиент температуры не должен превышать 1,5 °С/ч.

При использовании электроприборов частота переменного тока 50 +/- 1 Гц, напряжение сети 220 +/- 10 В.

Освещение помещения, естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.

8. Подготовка к проведению измерений

Все процедуры подготовки проб к анализу должны исключать возможность внесения в них загрязнений. Используемую для пробоподготовки фторопластовую посуду тщательно промывают в ультразвуковой ванне в разбавленной 1:1 азотной кислоте и трижды ополаскивают деионизованной водой.

9. Отбор, хранение и подготовка проб

Волосы состригают с затылочной части головы на всю длину в количестве не менее 0,1 г. Для снятия поверхностного загрязнения и обезжиривания волос применяется способ подготовки проб волос, рекомендованный МАГАТЭ. Для этого волосы обрабатываются ацетоном в течение 10 - 15 мин., а затем три раза промываются деионизованной водой. Сушка волос производится при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин. Для длительного хранения используют обычные бумажные конверты.

Для проведения анализа ногтей необходимо срезать ногти с обеих рук. Полученное количество ногтей обрабатывают ацетоном в течение 10 - 15 мин., а затем три раза промывают дистиллированной водой. Сушка ногтей производится при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин. Для длительного хранения используют обычные бумажные конверты.

Кровь может быть получена из локтевой вены (венозная, в условиях стационара) или из пальцев рук (капиллярная). Объем отобранной крови должен составлять не менее 1 мл. Образцы крови хранятся в обычном холодильнике до 3 - 5 сут. (от 0 до 4 °С), либо замораживаются (до -18 °С), либо лиофилизуются или высушиваются в сушильном шкафу (для длительного хранения). Для длительного хранения образцы помещаются в одноразовые полипропиленовые пробирки с герметичными крышками.

Забор и подготовка крови для получения препаратов эритроцитарной массы, плазмы и сыворотки, а также забор молока, спермальной жидкости, лаважа и слюны проводится по общепринятым методикам. Масса указанных препаратов для анализа должна составлять не менее 1 г. Для длительного хранения препараты помещают в герметичные одноразовые пробирки и замораживают до -18 °С либо лиофилизируют.

Моча (утренняя или суточная) для проведения анализа забирается в объеме не менее 5 мл. Для хранения мочу помещают в герметичную посуду (из лабораторного пластика) и хранят в холодильнике до 3 сут. при температуре от 0 до 4 °С.

Биоптаты мягких тканей (мышцы, кожа, эпителий, печень и др.) сразу же после забора, препарирования, удаления крови взвешиваются с точностью до 5 мг и помещаются в лабораторную пластиковую или стеклянную посуду, обеспечивающую герметичность хранения. Масса образца ткани от 0,1 г (минимальная, определение макроэлементов - железо, цинк, медь) до 3 - 5 г (определение содержания более 20 химических элементов). Допускается хранение в холодильнике при температуре 0 - 4 °С до 7 сут. или в морозильной камере при температуре -18 °С или высушивание и лиофилизация образцов для длительного хранения.

Пробы конкрементов - зубов, фрагментов костной ткани - особых условий хранения не требуют, помещаются в герметичную упаковку из лабораторного пластика.

Препараты аминокислот, поливитаминные препараты с микроэлементами, биологически активные добавки к пище и сырье для их изготовления поступают для исследования в упаковке производителя. Необходимая для исследования минимальная масса твердых препаратов составляет 10 г, жидких - 100 г.

10. Разложение проб биосубстратов

Волосы. Ногти. Другие твердые образцы. Открытое разложение. На аналитических весах берут навеску образца массой 0,01 - 0,10 г. TM Навеску помещают во фторопластовый цилиндр (PTFE, Viton , TM

Teflon  ,  PFA),  приливают 0,2 - 1,0 мл концентрированной азотной
кислоты, накрывают  защитной  лабораторной  пленкой  и  помещают в

термоблок, разогретый до 115 °C, выдерживают в течение 0,5 — 1,0 ч до полного растворения пробы. Растворенный образец количественно переносят в мерную полипропиленовую пробирку, троекратно смывая со стенок цилиндра, и доводят деионизованной водой до 10 мл. Герметично закрывают защитной лабораторной пленкой, перемешивают и передают на анализ.

Жидкие образцы. Открытое разложение. Навеску анализируемого объекта 0,1 — 0,5 г (0,1 — 0,5 мл) берут на аналитических весах во

                                     TM        TM
фторопластовые цилиндры (PTFE,  Viton  , Teflon  , PFA), определяя

массу навески по разнице массы пробирки до и после взятия навески.

В  цилиндр  приливают  0,3  -  1,0  мл  концентрированной  азотной
кислоты,  накрывают лабораторной пленкой и помещают  в  термоблок,

разогретый до 115 °С. Выдерживают в термоблоке в течение 0,5 — 1,0 ч до гомогенизации пробы и далее действуют, как описано в п. 10.

При работе с гомогенными водными средами, такими как моча (не содержащая осадка), лимфа, плазма и даже цельная кровь, допускается простое разбавление образца 2 — 3%-ной азотной кислотой непосредственно перед анализом. Для этого к навеске образца в мерной пробирке приливается 5 — 7 мл деионизованной воды, затем 0,3 — 0,5 мл концентрированной азотной кислоты и проба доводится до 10 — 15 мл деионизованной водой. В этом случае не рекомендуется уменьшать фактор разбавления пробы ниже чем 1:100 во избежание осаждения белков, а также для компенсации высокой вязкости образцов и склонности к пенообразованию. Пробы, растворенные таким способом, не рекомендуется хранить до анализа долгое время (свыше суток).

Микроволновая пробоподготовка. Навеску образца по п. п. 10, 11 помещают во фторопластовый вкладыш и добавляют 5 мл азотной кислоты. Автоклав с пробой во вкладыше помещают в микроволновую печь и разлагают пробу, используя программу разложения, рекомендованную производителем печи. В общем случае для мягких тканей, волос и жидкостей можно применять следующий режим нагрева: подъем температуры до 200 °С в течение 5 мин., выдерживание в течение 5 мин. при 200 °С, охлаждение до 45 °С. Охлажденный автоклав встряхивают для перемешивания содержимого и приоткрывают крышку для уравновешивания давления. Качественно разложенная проба после отгона окислов азота должна представлять собой бесцветный или желтоватый прозрачный раствор без нерастворившихся частиц на дне и на стенках вкладыша. Растворенную пробу количественно переносят в пробирку объемом 15 мл, троекратно встряхивая вкладыш с крышкой с 1 мл деионизованной воды и перенося каждый смыв в пробирку, доводят объем до 10 мл деионизованной водой, закрывают и перемешивают. Автоматическим дозатором со сменным наконечником отбирают аликвотную часть 1 мл и доводят до 10 мл 0,5%-ной азотной кислотой, закрывают защитной лабораторной пленкой, передают на анализ. Данные об объеме аликвотной части и объеме разведения вводят в программное обеспечение спектрометра вместе с названием и навеской образца.

Допускается непосредственный отбор аликвотной части объемом 0,1 — 0,5 мл из разложенной пробы в автоклаве. Чтобы скомпенсировать при этом погрешность разбавления, перед разложением в пробу нужно добавить раствор внутреннего стандарта (In или Rh), чтобы концентрация внутреннего стандарта в конечном растворе, направляемом на анализ, составляла примерно 10 мкг/л (например, добавить в пробу 100 мкл раствора, содержащего 10 мг/л Rh, затем из 5 мл разложенной пробы взять аликвотную часть 0,5 мл и довести до 10 мл). Раствор внутреннего стандарта необходимо добавлять во все холостые пробы и в калибровочные растворы. Заданную концентрацию внутреннего стандарта (10 мкг/л) в холостых и стандартных растворах необходимо точно соблюдать.

Раствор холостой пробы готовят с выполнением всех указанных выше операций, за исключением операции взятия навески.

11. Разложение проб аминокислот, поливитаминных препаратов с микроэлементами, биологически активных добавок к пище и сырья для их изготовления

Навеску измельченной пробы 0,1 — 0,2 г помещают во фторопластовый цилиндр, приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты, накрывают квадратом 2 x 2 лабораторной пленки и помещают в термоблок с температурой 115 °С на 0,5 — 1,0 ч до полного растворения пробы. Полученный прозрачный раствор количественно переносят в мерную полипропиленовую пробирку, троекратно смывая со стенок фторопластового цилиндра, и доводят деионизованной водой до 10 мл. Тщательно закрывают кусочком защитной лабораторной пленки, перемешивают и передают на анализ. При использовании микроволновой пробоподготовки действуют по п. 10.

Раствор холостой пробы готовят с выполнением всех указанных выше операций, за исключением операции взятия навески.

12. Приготовление стандартных градуировочных растворов

Рабочие стандартные растворы готовят путем смешивания нескольких опорных многоэлементных стандартных растворов для масс-спектрометрии, производства Perklin-Elmer или аналогичных, содержащих разные группы элементов. Для калибровки спектрометра используются два-три рабочих стандарта, содержащих, например, по 10, 40 и 100 мкг/л всех элементов, за исключением ртути, содержание которой составляет 1 и 4 мкг/л в первых двух стандартных растворах. Стандартный раствор, содержащий по 100 мкг/л элементов, используется для калибровки спектрометра для определения матричных элементов, таких как Na, Mg, Al, P, K, Ca, Fe, Zn. Для более точного определения матричных элементов может потребоваться применение стандартного раствора, в котором их концентрации были бы одного порядка с верхними границами диапазона содержаний элементов в исследуемом объекте, с учетом применяемого фактора разбавления. Приготовленные рабочие растворы сохраняются в полипропиленовых центрифужных пробирках объемом 50 мл. Рекомендуется использовать рабочие стандарты для калибровки в течение 3 — 5 дней после приготовления. Пример состава рабочих калибровочных растворов приведен в Прилож. 2.

13. Подготовка прибора

Масс-спектрометр подготавливают к работе в соответствии с руководством пользователя (инструкцией по эксплуатации). Необходимые режимы работы устанавливают в соответствии с рекомендациями производителя. Пример режима проведения измерений приведен в Прилож. 3. Для конкретного типа прибора оптимальные режимы могут быть установлены экспериментально. После запуска прибора производят проверку рабочих характеристик прибора, включая проверку чувствительности во всем диапазоне масс, проверку уровня фона, уровня вторичных оксидных и двузарядных ионов, воспроизводимости (путем расчета СКО по 5 — 6 последовательным измерениям сигналов).

14. Коррекция спектральных изобарных наложений, коррекция полиатомных наложений, вызванных матрицами образцов, реагентов и газами плазмы, коррекция транспортных помех

Коррекция трех основных видов помех в традиционном ИСП-МС анализе с вводом жидкой пробы (без применения динамических реакционных систем) проводится с использованием трех разных методов, отличающихся между собой как сложностью, так и надежностью. Выявление помех при отладке методики проводится путем определения стандартных добавок и измерением серии последовательно разбавленных проб.

Коррекция изобарных наложений. Примеры применяемых коррекции наложений от изобарных ионов приведены в табл. 1. В программных пакетах современных масс-спектрометров такие процедуры коррекции предлагаются автоматически. Точные коэффициенты коррекции определяются экспериментально.

Коррекция спектральных наложений от полиатомных ионов от разных источников требует большего внимания. Для устранения и коррекции спектральных наложений от полиатомных ионов в ИСП-МС применяются несколько способов. В скобках приведены элементы, при определении которых применяется конкретный вариант: - исключение из процесса пробоподготовки реагентов, вызывающих

спектральные наложения,  например  использование  азотной  кислоты
вместо   соляной,   которая  вызывает  образование  хлорсодержащих
полиатомных ионов  (для  V,  Cr,  As,  испытывающих  наложения  от

                 +      +

полиатомных ионов ClO , ArCl ); - удаление компонентов, вызывающих полиатомные наложения,

например,   при   помощи   окисления   или   упаривания  (удаление
органической  матрицы,  мешающей  определению  Cr,  Al,  Si  из-за

                 +    +    +

полиатомных ионов ArC , CN , CO ); - учет наложений при помощи эмпирических соотношений для

                                               40  35  +
накладывающихся ионов (например,  учет влияния   Ar  Cl  на  массе
           40  37  +
75 по иону   Ar  As  на массе 77 при определении As);

- <a id="p100123"></a>применение метода "холодной плазмы" для  анализа  элементов,

испытывающих  сильные  помехи  от полиатомных ионов из газа плазмы
                                                       56     40
(при подводимой мощности < 900 Вт возможно определение   Fe,    Ca

40 и K на уровне < 1 мкг/л в растворе); - применение десольватирующих устройств для обезвоживания и

высушивания  аэрозоля образца перед вводом в плазму (метод требует
приобретения дополнительного оборудования,  системы  десольватации
обладают    повышенным    эффектом    памяти   -   требуют   более
продолжительной   отмывки   между   образцами,   метод   устраняет
присутствие   полиатомных   ионов,   вызванных   только   матрицей

                    +    +      +

растворителя, — ионы ArO , NO , ArCl и т.д.);

• применение электротермической атомизации (ЭТА) или лазерной абляции (ЛА) для ввода пробы (метод ЭТА хорошо применим для устранения хлор- и кислородсодержащих помех, однако существенно уступает по себестоимости и возможностям современному методу коррекции с ДРС; метод ЛА используется для работы с твердыми гомогенными образцами, трудно поддается калибровке для медико-биологических исследований);
• применение ионно-молекулярных реакций для деструкции и фильтрации полиатомных ионов при работе на приборах с динамическими реакционными ячейками (метод устраняет влияние полиатомных ионов и улучшает пределы обнаружения на 1 — 3 десятичных порядка).

Наиболее серьезные помехи от матрицы образцов и от примесей в + + плазмообразующем аргоне вызываются полиатомными ионами NN и CO при анализе кремния. Все три изотопа кремния испытывают наложения, что уменьшает возможности определения Si в органических матрицах.

    При определении мышьяка в  биологических  образцах  с  высоким
содержанием  хлоридов  требуется  применение  уравнения  коррекции
                             40  35  +
влияния  полиатомного  иона    Ar  Cl   на  массе  75,  в  котором
                                              40  35  + 40  37  +
используется  соотношение  полиатомных  ионов   Ar  Cl /  Ar  Cl ,
                                            35   37
приблизительно равное природному отношению    Cl/  Cl,  также  при
                          77                   82
этом учитывается вклад от   Se на массе 77 (по   Se):

       75

I( As) = mass75 — 3,0 x (mass77 — [0,874 x ист.

                                   83
              x (mass82 - 1,0078 x   Kr)]),

где:
massNN - измеренный сигнал на соответствующей массе;

      75                          75
    I(  As)     - истинный сигнал   As.

       ист.

Коэффициенты в уравнении уточняются экспериментально, в ходе отладки рабочего метода.

    Для определения  Ti,  V  и Cr в образцах с высоким содержанием
хлоридов и/или  углерода  традиционным  методом  ИСП-МС  требуется
применять  довольно высокие факторы разбавления образцов (от 1:300

                                               +

до 1:500) для снижения уровня полиатомных ионов ClO (при работе с + мочой и кровью) и ArC (в присутствии органической матрицы) либо проводить измерения методом стандартных добавок.

Проблемы, связанные с полиатомными ионами, вызванными матрицей образцов, реагентов и газов плазмы, радикально устраняются при использовании для измерений приборов с динамической реакционной системой (ДРС). В системе ДРС используется дополнительный квадруполь — ячейка ДРС, расположенная перед квадруполем масс-анализатора. Влияние полиатомных ионов устраняется путем их избирательного разрушения в результате взаимодействий с молекулами нейтрального и/или реакционного газа, напускаемого в ячейку ДРС. В качестве реакционного газа обычно используется безводный аммиак или метан. Помимо проведения реакций, квадруполь ячейки ДРС обеспечивает динамическое выделение узкого диапазона пропускания интересующих ионов и препятствует продвижению паразитных продуктов реакций к квадруполю масс-анализатора. Таким образом, система ДРС осуществляет эффективную фильтрацию полиатомных ионов, уменьшает общий фон и увеличивает стабильность сигналов. Эти особенности ИСП-ДРС-МС приборов позволяют достигать лучших пределов обнаружения, уверенно определять традиционно трудные элементы для ИСП-МС определений в органических матрицах (Si, K, Ca, Ti, V, Cr, Fe, As, Se), а также проводить более точный изотопный анализ вещества.

Устранение и учет транспортных помех. Транспортные помехи возникают из-за различия в вязкости и поверхностном натяжении между градуировочными стандартами и образцами. Вязкость растворов влияет на эффективность распыления и, как следствие, воздействует на сигнал каждого анализируемого изотопа в растворе, в идеале пропорционального его концентрации. Вязкость водных растворов зависит от концентрации кислоты и от концентрации матричных компонентов. Используя довольно высокие факторы разбавления для образцов с остаточной органической матрицей (1:300 — 1:500) и нормализуя кислотный фон в стандартах, холостых и образцах, влияние транспортных помех можно уменьшить до незначимого уровня. При работе с меньшими факторами разбавления (от 1:10 до 1:100 для мочи, крови и т.д.) рекомендуется убедиться в отсутствии помех, проанализировав серию последовательных разбавлений одной пробы (например, 1:10, 1:50, 1:100, 1:200), и выбрать компромиссный фактор разбавления, при котором не страдает чувствительность определения интересующих элементов. Если транспортные помехи невозможно устранить, следует применить внутреннюю стандартизацию, добавляя во все холостые пробы, стандартные растворы и образцы внутреннего стандарта раствор Rh или In, чтобы получить конечную концентрацию во всех растворах 10 мкг/л. Применение внутренней стандартизации также позволяет компенсировать погрешности разбавления образцов и учесть многие матричные влияния на плазму и поток ионов.

15. Градуировка масс-спектрометра

Калибровку спектрометра выполняют перед началом измерений полностью подготовленных проб, используя градуировочные растворы по п. 12 при параметрах, установленных по п. 13. Определение градуировочной зависимости, обработка и хранение результатов калибровки выполняются программным обеспечением спектрометра.

Проверка калибровок проводится перед началом анализа образцов. Проверка заключается в измерении внутрилабораторного проверочного стандарта или стандартного аттестованного образца исследуемой матрицы. Современные программные пакеты для ИСП-МС систем позволяют задавать критерии допустимого качества калибровок, основанные на точности и воспроизводимости результатов для проверочных стандартов, а также на коэффициенте корреляции, и программировать алгоритм автоматических измерений, который может включать повторные проверки калибровок и перекалибровки без участия оператора.

Для выявления и учета дрейфа чувствительности прибора повторные измерения проверочных стандартов и/или полные перекалибровки рекомендуется проводить каждые 1 — 2 ч работы (через каждые 15 — 30 образцов), в зависимости от стабильности окружающей температуры, питающего напряжения и других условий в лаборатории.

16. Выполнение измерений

Ввод в масс-спектрометр подготовленной пробы, измерение сигналов изотопов проводят при нормальных климатических условиях испытаний в соответствии с п. 10 с учетом требований руководства (инструкции) по эксплуатации прибора. Устанавливают оптимальный режим регистрации масс-спектров и измерений в соответствии с рекомендациями производителя данного прибора. Типичные установки рабочих параметров при измерениях приведены в Прилож. 2. Первичная обработка сигналов и расчет концентраций проводится программным обеспечением автоматически на основании параметров используемого метода и данных проведенной калибровки.

Выбор изотопов для определения концентрации элементов. Для измерений используются изотопы, наиболее предпочтительные по совокупности характеристик. Важнейшими из них являются относительная распространенность, отсутствие или низкий уровень спектральных полиатомных наложений, достигаемый предел обнаружения. При отладке программного метода проводят измерения в режиме сканирования пиков для определения возможных влияний от прилежащих пиков и установки оптимального разрешения для каждого изотопа. Примеры выбора оптимальных масс и достигаемых при этом пределов обнаружения приведены в Прилож. 4.

17. Обработка результатов измерений

Аналитические сигналы обрабатываются программным обеспечением масс-спектрометра, основываясь на построенных калибровочных линейных регрессиях, рассчитанных методом наименьших квадратов, с учетом коррекции фона, сигнала внутренних стандартов, а также с учетом влияния изобарных и полиатомных спектральных наложений. Результат определения каждого элемента представляется как среднее из нескольких (не менее двух) параллельных измерений анализируемого образца. Обработка результатов измерений соответствует ГОСТ 8.207. Результаты измерений отображаются на мониторе, распечатываются и/или сохраняются в виде файла на жестком диске компьютера. Распечатанные результаты оформляют согласно требуемому протоколу (Прилож. 5).

18. Внутренний оперативный контроль

Контроль погрешности методики производят в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6-94. Внутренний контроль качества результатов определения микроэлементов (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению. Оперативный контроль качества осуществляют путем проведения анализа испытуемых проб и стандартного образца, химический состав которого не должен отличаться от состава испытуемой пробы настолько, чтобы потребовалось изменить методику проведения анализа.

Оперативный контроль воспроизводимости

Периодичность контроля воспроизводимости результатов анализа определяется количеством рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля. В работе участвуют 2 аналитика. Образцами для контроля являются представительные пробы, каждую из которых анализируют в точном соответствии с прописью, максимально варьируя условия проведения анализа: получают два результата, используя разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов и разные экземпляры стандартных образцов для градуировки прибора.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                      _    _              _
                     |X  - X | <= 0,01D x X,
                       1    2

где:
_
X  - результат анализа рабочей пробы, мкг/г;
 1
_
X  -  результат  анализа  этой  же  пробы,  полученный  другим
 2

аналитиком с использованием другого прибора, другой мерной посуды и другой партии реактивов, мкг/г; D — допустимые расхождения между результатами анализа одной и той же пробы, %.

При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива D выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам работы и контроля, и устраняют их.

Оперативный контроль точности

Периодичность контроля воспроизводимости результатов анализа определяется количеством рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля. Используют технику метода стандартных добавок или, при наличии стандартных образцов состава, выполняют их анализ. Рекомендуется использовать стандартные образцы человеческих волос, крови, сыворотки, мочи, тканей и органов животных и растений, а также аминокислотных и поливитаминных препаратов с микроэлементами, производимых агентствами по стандартным образцам (NCCRM — Китай, NIST — США, IRMM — Объединенная Европа, NIES — Япония), а также специализированными фирмами (Bio-Rad, Seronorm, Sigma-Aldrich, Merck и др.).

Метод стандартных добавок. Отбирают две пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы содержание определяемого элемента увеличилось по сравнению с исходным на 50 — 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы X и рабочей пробы с добавкой X' получают в строго одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

|X' — X - С| < К , Д

где:
К - норматив оперативного контроля погрешности, мкг/г;
С - добавка к пробе в виде раствора с концентрацией, мкг/г.

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:

                        _________________

                           /     2          2
                   К' =   /ДЕЛЬТА   + ДЕЛЬТА ,
                    Д   \/       X'         X

              2           2
    где ДЕЛЬТА   и  ДЕЛЬТА    -  характеристики  погрешностей  для
              X'          X

исходной пробы и пробы с добавкой, мкг/г.

             ДЕЛЬТА   = 0,165 X' и ДЕЛЬТА  = 0,165 X.
                   X'                    X

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что:

К' = 0,84 x К . Д Д

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.

Метод стандартных образцов. Выполняют анализ пробы, приготовленной из стандартного образца, по методике и сравнивают его результаты с аттестованным содержанием элементов. Погрешность аттестации не должна быть большей чем 1/3 погрешности методики.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                        _

|С — А| < К,

где:
_

С — найденное содержание элемента в пробе, приготовленной из стандартного образца;

А = ДЕЛЬТА — аттестованное содержание элемента в стандартном А образце.

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) принимают, что:

К = 0,84 x ДЕЛЬТА.

При внешнем контроле (Р = 0,95) принимают:

К = ДЕЛЬТА,

где ДЕЛЬТА — общая погрешность результата анализа по методике.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.

Оперативный контроль сходимости

Периодичность контроля сходимости результатов анализа определяется количеством рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля. Используют результаты параллельных анализов.

Норматив оперативного контроля сходимости рассчитывают по формуле:

                        с    - с    <= d,
                         max    min

где:

    с   , с    - наибольшее  и  наименьшее  значения  параллельных
     max   min

определений;

    d - норматив  оперативного  контроля  воспроизводимости,  d  =
2,77 сигма(ДЕЛЬТА),    где    сигма(ДЕЛЬТА)    -    характеристика

составляющей случайной составляющей погрешности.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их путем корректирующих воздействий.

    Примечание. Пределы  определения  рассчитаны  по   стандартной
методике  при 98%  доверительном интервале,  как 3 x СКО     / ES,

                                                    фона

где 3 - значение распределения Стьюдента для  98%-го  интервала  и
семи  степеней свободы,  СКО     - стандартное отклонение фонового

                        фона

сигнала (имп./с), рассчитанное по восьми репликам чтения, ES — -1 изотопная чувствительность, выраженная в имп./с x мкг x л [16].

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений.

2. Методика определения микроэлементов в диагностирующих биосубстратах атомной спектрометрией с индуктивно связанной аргоновой плазмой. Методические рекомендации. М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. 23 с.

3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений.

4. Скрининговые методы для выявления групп повышенного риска среди рабочих, контактирующих с токсичными химическими элементами: Методические рекомендации / Сост. П.Н. Любченко и др. Утв. МЗ СССР. М., 1989.

5. Выявление и коррекция нарушений обмена макро- и микроэлементов. Методические рекомендации / Правительство Москвы. Комитет здравоохранения. Сост. А. В. Скальный и др. М., 2000.

6. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А. и др. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология. М.: Медицина, 1991. 496 с.

7. Скальный А.В. Микроэлементозы человека (диагностика и лечение). М.: КМК, 1999. 96 с.

8. Преображенский В.Н., Ушаков И.Б., Лядов К.В. Активационная терапия в системе медицинской реабилитации лиц опасных профессий. М.: Паритет, 2000. 320 с.

9. Нарушение минерального обмена у детей в г. Москве / Информационное письмо № 15. Правительство Москвы. Комитет здравоохранения, 2000.

10. Качество лабораторного анализа (Приказ Минздрава РФ от 07.02.00 № 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения РФ») // Библиотека журнала «Качество медицинской помощи». № 2. М.: Грантъ, 2000. 40 с.

11. <a id="p100337"></a>Perkin-Elmer   SCIEX   Instruments   ELAN  ICP-MS  system.
                                                            TM

Руководство пользователя. Техническая документация. Perkin-Elmer Instruments, 2002.

12. Методические инструкции 2335-95. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа. Екатеринбург, 1997.

13. Скальный А.В., Яцык Г.В., Одинаева Н.Д. Микроэлементозы у детей: распространенность и пути коррекции. Практическое пособие для врачей. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2002. 86 с.

14. Одинаева Н.Д., Яцык Г.В., Скальный А.В. и др. Диагностика и коррекция нарушений обмена макро- и микроэлементов у детей первого года жизни. Пособие для врачей. М.: ООО «Накра принт», 2002. 48 с.

15. Plasma source mass spectrometry: New developments and applications / Eds.: Holland J.G., Tanner S.D. London: Royal Society of Chemistry, 1999. 300 p.

16. Yoko Kishi, Katsu Kawabata. «The best way to measure the performance of an ICP-MS». Semiconductor News. Vol. 2. Issue 1. Perkin-Elmer Sciex, 2001. P. 4 — 5.