МУК 4.1.1456-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Кломазона в воде, почве, зерне, соломе риса, семенах и масле сои хроматографическими методами

(утв. Минздравом России 24.06.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КЛОМАЗОНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ, СОЛОМЕ РИСА, СЕМЕНАХ И МАСЛЕ СОИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

МУК 4.1.1456-03

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: «ФМСи» (США).

Торговое название: Комманд.

Название действующего вещества по ИСО: Кломазон.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-(2-хлорбензил)-4,4-диметил-1,2-оксазолидин-3-он или 2-(2-хлорбензил)-4,4-диметилзоксазолидин-3-он.

Структурная формула (не приводится).

    Эмпирическая формула: C  H  ClNO .
                           12 14    2

Молекулярная масса: 239,7.

Химически чистый Кломазон представляет собой вязкую светло-коричневую жидкость с удельной массой 1,192 г/куб. см (при 20 °С) и температурой кипения 275,4 °С.

Давление паров: 19,2 мПа (при 25 °С).

Растворимость в воде при 25 °С: 1,1 г/л; в органических растворителях — хорошо смешивается: с хлороформом, ацетоном, циклогексаноном, н-гексаном, метанолом, ацетонитрилом, хлористым метиленом, толуолом, гептаном.

    Коэффициент  распределения  в  системе октанол/вода при 25 °С:
К   log Р = 2,5.

ow

Устойчив при хранении; при комнатной температуре может храниться без потерь в течение года, при 50 °С — в течение 3 мес.

Период полуразложения на свету в водном растворе более 30 сут., в почве — 30 — 135 сут. (в зависимости от почвенно-климатических условий).

    Краткая  гигиеническая  характеристика:  Кломазон  относится к
веществам  малоопасным по острой пероральной (ЛД   для крыс - 1369

                                            50

• 2077 мг/кг), дермальной (ЛД для кроликов — более 2000 мг/кг) и 50 умеренно опасным по ингаляционной (ЛД крысы, 4 часа, — 4,8 мг/л) 50

токсичности.  Препарат слабо раздражает кожу и конъюнктиву, опасен
при   вдыхании  паров.  В  опытах  по  изучению  тератогенности  и
мутагенности  отрицательного  действия  на  подопытных животных не

наблюдается.

В России установлены следующие гигиенические нормативы для Кломазона:

ДСД — 0,04 мг/кг массы тела человека.

ОБУВ в воздухе атмосферы при применении — 1,0 мг/куб. м.

ОБУВ в воздухе рабочей зоны при применении — 1,0 мг/куб. м.

ПДК в воде водоема — 0,02 мг/л.

ПДК для воды рыбохозяйственных водоемов — 0,01 мг/л.

ПДК/ОДК в почве — не нормирован.

ВМДУ (мг/кг): рис — 0,2; рис (солома) — 0,1; соя (семена и масло) — 0,01.

Область применения препарата. Кломазон — гербицид избирательного, системного действия, блокирующий биосинтез фотосинтетических пигментов. Он хорошо проникает в растения через корни и листья и подавляет рост и развитие двудольных и злаковых сорняков в посевах сои, кукурузы, рапса, гороха и риса при довсходовом, послевсходовом или предпосевном внесении. Норма расхода гербицида — 0,35 — 0,5 кг/га по действующему веществу. В смесях с другими гербицидами (в дозах 50 — 150 г/га по д.в.) используется для борьбы с сорняками в посевах рапса, картофеля, хлопчатника и ряда бобовых культур.

Кломазон зарегистрирован в России под торговым названием Комманд, 480 г/л, к.э. и 360 г/л, МКС, в качестве гербицида для подавления однолетних двудольных и злаковых сорняков в посевах сои 0,7 — 1,0 л/га и риса 1,0 — 1,2 л/га соответственно.

2. Методика определения остаточных количеств Кломазона в почве, воде, зерне и соломе риса, семенах и масле сои хроматографическими методами

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на определении Кломазона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектором после его экстракции из воды и растительного материала н-гексаном, из почвы смесью ацетонитрила с водным раствором хлорида кальция, из масла сои подкисленным водным ацетонитрилом с последующей переэкстракцией в н-гексан, очистки экстракта на колонке с оксидом алюминия. Для семян сои предлагаются альтернативные методики с использованием газожидкостной или тонкослойной хроматографии.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки для ВЭЖХ и ГЖХ, а для метода ТСХ — визуального сравнения хроматографических пятен аналитического стандарта и пробы.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода приведена в таблицах 1 — 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА (Р = 0,95, n = 24)

Анализируемый объект		Предел обнаружения, мг/кг (мг/л)	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/л)	Среднее значение определения, %	Доверительный интервал среднего результата, %	Стандартное отклонение S, %
Вода	Питьевая открытый водоем (пруд)	0,005 0,005	0,005 — 0,020 0,005 — 0,020	93,4 92,2	+/- 1,9 +/- 1,5	9,5 7,8
Почва	дерновоподзолистая чернозем выщелоченный	0,01 0,01	0,01 — 1,00 0,01 — 1,00	85,2 87,7	+/- 3,2 +/- 3,1	15,9 15,1
Растения	зерно риса солома риса	0,05 0,05	0,05 — 0,40 0,05 — 0,40	86,1 89,2	+/- 1,30 +/- 1,04	6,3 5,0
	масло сои	0,005	0,005 — 0,10	85,1	+/- 3,5	7,0
	семена сои ГЖХ ТСХ	0,005 0,05	0,005 — 1,0 0,05 — 5,0	82,1 81,0	+/- 20,3 +/- 18,2	16,3 14,6

Анализируемый объект		Внесено вещества, мг/кг (мг/л)	Определено вещества, мг/кг (мг/л)	Полнота определения, %
Вода	питьевая	0,002 0,005 0,01 0,02	0,0019 +/- 0,00009 0,0044 +/- 0,00015 0,0094 +/- 0,00044 0,0179 +/- 0,00074	90,2 90,9 95,2 98,9
Вода	открытый водоем (пруд)	0,002 0,005 0,01 0,02	0,0019 +/- 0,00006 0,0044 +/- 0,00013 0,0093 +/- 0,00037 0,0182 +/- 0,00072	89,5 91,6 92,2 94,2
Почва	дерновоподзолистая	0,01 0,02 0,04 0,08	0,0073 +/- 0,0008 0,0180 +/- 0,0015 0,0346 +/- 0,0027 0,0780 +/- 0,0024	73,3 85,0 86,6 95,8
	чернозем выщелоченный	0,01 0,02 0,04 0,08	0,0090 +/- 0,0020 0,0175 +/- 0,0012 0,0370 +/- 0,0012 0,0766 +/- 0,0055	83,3 85,8 90,0 92,0
Растения	зерно риса	0,05 0,10 0,20 0,40	0,0435 +/- 0,00120 0,0866 +/- 0,0022 0,1701 +/- 0,0060 0,3370 +/- 0,0126	84,3 85,3 86,6 88,0
	солома риса	0,05 0,10 0,20 0,40	0,0416 +/- 0,0018 0,0906 +/- 0,0013 0,1828 +/- 0,0022 0,3670 +/- 0,0052	83,3 85,3 90,6 91,7
	масло сои	0,005 0,01 0,02 0,10	0,0046 +/- 0,0012 0,0089 +/- 0,0015 0,0162 +/- 0,0027 0,0788 +/- 0,0044	92,6 89,5 80,0 78,3

2.1.3 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен и может применяться для анализа Кломазона в почве, растительном материале риса и масле сои, обрабатываемых другими пестицидами.

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

2.2.1 Реактивы, материалы и растворы

Кломазон аналитический стандарт (FMC 57020) с содержанием 99,7% д.в.;

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74;

Алюминия оксид (Al О , L40/250, М = 101,96), Chemopol; 2 3(нейтр.)

Аммиак водный, 25%, ч.д.а.;

Аммиак водный, ГОСТ 3760-79;

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79;

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83;

Бумага универсальная индикаторная, Merck;

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72;

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78;

Кальций хлористый, pure, Art. 2388, Merck;

Кислота уксусная ледяная, ч.д.а., ГОСТ 61-75;

Кислота уксусная, х.ч., ГОСТ 61-75;

Кислота хлороводородная, 6 М раствор;

Кислота хлороводородная, х.ч., ГОСТ 3118-77;

Метанол, х.ч., ТУ 6-09-11-1643-82;

Натр едкий, ч.д.а., ГОСТ 4328-77, 20%-ный раствор;

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76;

Неподвижные фазы для ГЖХ:

• SE-30, 5%, на Хроматоне N-AW-DMCS, зернение — 0,125 — 0,16 мм;
• OV-17, 1,5% и QF-1, 1,95%, на Хроматоне N-AW-DMCS, зернение — 0,125 — 0,16 мм, Хеманол, Чехия;

Серебра нитрат, х.ч., ГОСТ 1277-75;

Стекловата для хроматографии, Serva;

Фильтры бумажные «синяя лента» диаметром 11,0 см, обеззоленные, ТУ 6-09-1678-86.

2.2.2 Посуда и оборудование

Хроматограф жидкостный «Beckman System Gold» с ультрафиолетовым детектором «Spectroflow 757» или другой аналогичного типа;

Колонка для ВЭЖХ стальная Ultrasphere ODS (4,6 х 250 мм), 5 мкм;

Хроматограф газовый «Цвет 106» с ДПР или аналогичный;

Колонки стеклянные для ГЖХ, длина 1 и 2 м, диаметр 3 мм;

Хроматограф газовый «Кристалл-2000» с ДЭЗ и аналого-вычислительным комплексом и испарителем для капиллярной колонки или аналогичный;

Колонка капиллярная с OV-1, длина 25 м, внутренний диаметр — 0,2 мм;

Аппарат для встряхивания проб АВУ-1, ТУ 64-1-1081-7, или другой аналогичного типа;

Баня водяная СН-9230 FLAWIL/SG, Buchi, или другая аналогичного типа;

Весы аналитические FX-40 A&D Company, АД-20, ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или другие аналогичного типа;

Весы лабораторные технические ВЛТК-500 или другие аналогичного типа;

Воронки Бюхнера, ГОСТ 9147-80;

Воронки делительные на 250 мл, ГОСТ 10054-75;

Воронки химические конические, ГОСТ 25336-82Е;

Иономер модель И-135, ТЗАП или другой аналогичного типа;

Испаритель ротационный Rotavapor R110 Buchi или ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, с водяной баней или другой аналогичного типа;

Источник УФ-света ртутно-кварцевый, ТУ 16-535-280-74, или аналогичный;

Камера хроматографическая;

Колбы Бунзена, ГОСТ 6514-74;

Колбы грушевидные (концентраторы), ГОСТ 10394-72;

Колбы конические плоскодонные вместимостью 100, 250 и 500 мл, КШП-100, КШП-250, ГОСТ 10394-72;

Колбы мерные вместимостью 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74;

Колонка хроматографическая стеклянная или пластиковая диаметром 15 мм и длиной 15 см;

Концентраторы грушевидные (конические) НШ29 КГУ-100-14/19, ТС, ГОСТ 10394-72;

Мельница (для размола зерна и соломы) электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная;

Микропипетки (для нанесения растворов) вместимостью 0,1 — 0,2 мл, ГОСТ 20292-74;

Микрошприцы Hamilton company на 50 и 100 мкл или другие аналогичного типа;

Микрошприц МШ-1И на 10 мкл или аналогичный, ГОСТ 20292-74Е;

Палочки стеклянные, ГОСТ 25336-82Е;

Пипетка цифровая автоматическая с максимальной емкостью 5 мл, Aldrich Chemical Company, Wheaton, или другая аналогичного типа;

Пластинки хроматографические типа Силуфол УФ , Хемапол, 254 Чехия, или аналогичные;

Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 25336-82Е;

Самописец модель ВД40 Kipp & Zonen или другой аналогичного типа;

Скальпель или нож;

Стаканы химические стеклянные на 100 мл, ГОСТ 6236-72;

2.3. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» № 2051-79 от 21.08.79.

Пробы воды в стеклянной или инертной полиэтиленовой таре хранят при температуре 0 — 4 °С в течение не более 7 суток, для длительного хранения пробы замораживаются и хранятся при -18 °С. Отобранные пробы соломы и зерна риса подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при температуре 0 — 4 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, солому и зерно риса измельчают на лабораторной мельнице. Пробы масла сои в стеклянной или инертной полиэтиленовой таре хранят при температуре 0 — 4 °С в течение не более 7 сут., для длительного хранения пробы хранятся при -18 °С.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В колбу на 1000 мл вносят 600 мл метанола, добавляют 390 мл бидистиллированной воды и 10 мл уксусной кислоты. Полученный раствор метанол:вода:уксусная кислота (60:39:1 по объему) фильтруют и дегазируют.

2.4.2 Кондиционирование колонки

Промывают колонку для ВЭЖХ системой метанол:вода:уксусная кислота (60:39:1 по объему) в течение 30 мин. при скорости подачи подвижной фазы 1,5 мл/мин. Включают детектор и ожидают стабилизацию базовой линии (10 — 20 мин.).

2.4.3 Подготовка хроматографической колонки, заполненной оксидом алюминия, для очистки экстракта масла сои

На дно стеклянной или пластиковой хроматографической колонки помещают пробочку из стекловаты или специальный фильтр. В колонку вносят, осторожно присыпая сверху, 6 г оксида алюминия и затем осторожно вносят на поверхность адсорбента 2 г безводного сернокислого натрия. При заполнении колонки по ее стенкам слегка постукивают картонной трубкой для равномерного уплотнения (распределения) фазы.

Активацию готовой колонки проводят, пропуская 5 мл н-гексана. Смывы отбрасывают. Хроматографическую колонку плотно закрывают пробкой и хранят до использования.

2.4.4 Проверка хроматографического поведения Кломазона на колонке

При отработке методики или поступлении новой партии оксида алюминия проводят изучение поведения Кломазона на колонке.

В концентратор объемом 50 мл вносят 1 мл стандартного раствора Кломазона в гексане с концентрацией 1 мкг/мл и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 25 — 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл гексана и полученную смесь наносят на подготовленную (пункт 2.4.3) колонку. Затем промывают колонку 5 мл гексана и элюат отбрасывают. Кломазон элюируют с колонки последовательно 5-ю порциями объемом 5 мл каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и упаривают досуха при температуре не выше 25 — 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 — 5 мл раствора «А» и 100 мкл пробы вводят в хроматограф.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и определяют необходимый объем элюата для полного смыва Кломазона с колонки.

2.4.5 Приготовление рабочих растворов

2.4.5.1 Приготовление 0,05 н раствора хлористого кальция (гидрофилита)

2,75 г хлористого кальция переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 600 — 700 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения вещества и доводят водой до метки.

2.4.5.2 Приготовление 0,024 н раствора соляной кислоты

2 мл концентрированной соляной кислоты переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 600 — 700 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения вещества и доводят водой до метки.

2.4.5.3 Приготовление раствора «А»

50 мл метанола вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют 600 — 700 мл 0,024 н раствора соляной кислоты, перемешивают до полного растворения вещества и доводят 0,024 н раствором соляной кислоты до метки.

2.4.6 Приготовление стандартных растворов

ВЭЖХ — 10 мг Кломазона (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют навеску в метаноле и доводят объем до метки метанолом (стандартный раствор № 1, концентрация 100 мкг/мл). Раствор хранится в холодильнике до 120 сут.

Методом последовательного разбавления исходного раствора № 1 раствором «А», готовят рабочие растворы Кломазона с концентрацией 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/мл, которые могут храниться в холодильнике не более 30 сут.

ГЖХ и ТСХ. 10 мг Кломазона (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют навеску в н-гексане и доводят объем до метки гексаном (стандартный раствор № 2, концентрация 100 мкг/мл). Раствор хранится в холодильнике до 120 сут.

ГЖХ. Методом последовательного разбавления исходного раствора № 2 гексаном готовят рабочие растворы Кломазона с концентрацией 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/мл, которые могут храниться в холодильнике не более 30 суток.

ТСХ. Методом последовательного разбавления исходного раствора № 2 гексаном готовят рабочие растворы Кломазона с концентрацией 5; 20 и 50 мкг/мл.

2.4.7 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика в жидкостный хроматограф вводят по 100 мкл (газожидкостный — 5 мкл) раствора Кломазона с концентрацией 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/мл. Проводят не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации Кломазона в растворе в мкг/мл (рис. 1 — не приводится).

2.4.8 Приготовление проявляющего реагента

Взвешивают 0,5 г нитрата серебра, переносят навеску в мерную колбу объемом 100 мл и растворяют нитрат серебра в 5 мл дистиллированной воды. После полного растворения кристаллов в колбу прибавляют 7 — 10 мл аммиака, перемешивают раствор и доводят объем до метки ацетоном. Для обработки одной пластинки берут 10 мл реагента. После обработки проявляющим реагентом хроматограмму облучают УФ-светом в течение 30 — 40 мин.

2.5. Проведение определения

2.5.1 Вода

Образец воды объемом 100 мл фильтруют через двойной складчатый фильтр (синяя лента) в делительную воронку на 250 мл, подкисляют 1 н соляной кислотой до рН 2,0 и к нему добавляют 15 мл н-гексана. Воронку встряхивают в течение 2-х минут, и после разделения слоев водную фракцию сливают в коническую колбу. Гексановую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 мл. Водную фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию Кломазона из воды повторяют еще два раза, используя каждый раз по 15 мл н-гексана и встряхивая воронку две минуты. Экстракты объединяют в концентраторе и выпаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С досуха. Сухой остаток растворяют в 1 — 5 мл раствора «А» и аликвоту 100 мкл вводят в жидкостный хроматограф.

2.5.2 Почва

Навеску почвы 20 г (в пересчете на воздушно-сухую почву) помещают в коническую колбу на 100 мл, приливают 40 мл смеси ацетонитрила с 0,05 н водным раствором хлористого кальция (1:1). Встряхивают колбу в течение 1 часа. После этого экстракт фильтруют через двойной складчатый фильтр (синяя лента) методом декантации в колбу на 100 мл. Экстракцию повторяют еще раз, используя 20 мл растворителя и встряхивая в течение 20 минут. Экстракты объединяют и из объединенного экстракта отбирают аликвоту объемом 30 мл в концентратор. При температуре 55 °С, используя ротационный вакуумный испаритель, выпаривают ацетонитрил до водного остатка.

К водному остатку добавляют 1 н соляной кислоты для достижения рН 1 — 2, переносят его в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют Кломазон н-гексаном (трижды по 20 мл), как указано выше. Объединенный гексановый экстракт собирают в концентраторе и упаривают при температуре 40 °С на вакуумном ротационном испарителе досуха. Сухой остаток растворяют в 1 — 5 мл раствора «А» и аликвоту 100 мкл вводят в жидкостный хроматограф.

2.5.3 Зерно и солома риса

Растительную пробу, измельченную в порошок на электрической мельнице (зерно — 10 г, солома — 5 г), помещают в коническую колбу на 250 мл. Приливают 50 мл н-гексана и экстрагируют при встряхивании 1 час. Экстракт фильтруют в колбу на 250 мл через безводный сульфат натрия, помещенный на двойной складчатый фильтр (синяя лента). Экстракцию повторяют с 50 мл н-гексана в течение 30 минут. Фильтр с осадком промывают дважды 5 мл н-гексана. Объединенный фильтрат переносят в концентратор и при температуре 40 °С выпаривают н-гексан досуха, используя вакуумный ротационный испаритель. Сухой остаток растворяют в 1 — 5 мл раствора «А» и аликвоту 100 мкл вводят в жидкостный хроматограф.

2.5.4 Семена сои

Пробу семян сои, измельченную на мельнице массой 10 г, помещают в коническую колбу на 250 мл. Приливают 25 мл н-гексана и экстрагируют при встряхивании в течение 30 мин. Экстракт фильтруют в колбу на 250 мл через безводный сульфат натрия, помещенный на двойной складчатый фильтр (синяя лента). Экстракцию повторяют с 25 мл н-гексана в течение 30 минут. Фильтр с осадком промывают дважды 5 мл н-гексана. Объединенный фильтрат переносят в концентратор и при температуре 40 °С выпаривают н-гексан досуха, используя вакуумный ротационный испаритель.

Методы хроматографирования:

ВЭЖХ — Сухой остаток растворяют в 1 — 5 мл раствора «А» и аликвоту 100 мкл вводят в жидкостный хроматограф.

ГЖХ — Сухой остаток растворяют в 0,1 мл н-гексана и аликвоту 5 мкл вводят в газовый хроматограф.

ТСХ — Сухой остаток растворяют в 0,1 мл н-гексана и весь объем наносят на пластинку.

2.5.5 Масло сои

2.5.5.1 Экстракция Кломазона

Навеску масла сои (10 г) помещают в колбу вместимостью 250 мл, приливают 30 мл смеси ацетонитрил: 0,024 н соляная кислота (1:1) и в течение 5 мин. на аппарате для встряхивания содержимое колбы перемешивают. После расслаивания прозрачный верхний слой отфильтровывают через бумажный фильтр «синяя лента» в концентратор вместимостью 100 мл. Операцию повторяют еще два раза, используя 30 мл подкисленного водного раствора ацетонитрила (1:1) каждый раз и объединяя водно-ацетонитрильную фазу в концентраторе. Из объединенных экстрактов при 55 °С, используя ротационный вакуумный испаритель, выпаривают ацетонитрил.

Водный остаток переносят в делительную воронку, добавляют 10 мл дистиллированной воды и реэкстрагируют Кломазон трижды н-гексаном, добавляя каждый раз 15 мл растворителя и встряхивая 1 мин. Водную фазу отбрасываю. Гексановые экстракты объединяют в концентраторе, пропуская через безводный сернокислый натрий, и упаривают досуха при 40 °С.

2.5.5.2 Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток в концентраторе тщательно растворяют в 1,0 мл гексана и переносят на колонку. После впитывания раствора на колонку наносят 5 мл н-гексана, предварительно ополоснув им концентратор, и после прохождения через колонку фракцию отбрасывают. Промывают колонку 5 мл смеси гексан:ацетон (4:1), которые отбрасывают. Кломазон смывают с колонки последующими 10 мл смеси гексан:ацетон (4:1). Собранный элюат помещают в концентратор и упаривают досуха при температуре 45 °С.

Сухой остаток после очистки растворяют в 1 — 5 мл раствора «А» и аликвоту 100 мкл вводят в жидкостный хроматограф.

Примечание: При необходимости подобную очистку можно применять при анализе зерна риса и семян сои.

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

2.6.1 Условия хроматографирования

2.6.1.1 ВЭЖХ

Высокоэффективный жидкостный хроматограф «Beckman System Gold» с УФ-детектором «Spectroflow 757».

Колонка стальная для ВЭЖХ Ultrasphere ODS с внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 250 мм, зернением сорбента 5 мкм.

Абсолютное время удержания Кломазона — 9 мин.

Чувствительность: 0,01 ед. оптической плотности на шкалу.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.

Минимально детектируемое количество Кломазона в анализируемом объеме — 2 нг.

Объем вводимой пробы — 100 мкл.

Подвижная фаза — метанол + вода + 1%-ный водный раствор уксусной кислоты (60:39:1 по объему).

Рабочая длина волны — 240 нм.

Скорость потока — 1,5 мл/мин.

Скорость движения ленты самописца — 1 мм/мин.

Температура колонки — комнатная.

Альтернативные условия.

Хроматограф жидкостный микроколоночный «Милихром».

Детектор спектрофотометрический.

Длина волны: 240 нм.

Микроколонка «Силасорб 600, 5 мкм, Хемапол, Чехия.»

Подвижная фаза гептан или смесь гексана с ацетоном в соотношении 6:1.

Скорость потока: 200 мкл/мин.

Поддиапазон чувствительности: 3,2 А, время измерения: 0,6 с.

Скорость движения ленты самописца — 12 мм/мин.

Объем удерживания Кломазона 295 мкл.

2.6.1.2 ГЖХ с набивными колонками

Хроматограф «Цвет-106» с детектором постоянной рекомбинации -14 ионов с пределом детектирования по Линдану не выше 4 х 10 г/куб. см или аналогичный.

Колонка стеклянная спиральная, длина 1 м, внутренний диаметр 3 мм.

Носитель Хроматон-N-AW-DMCS, размер частиц 0,125 — 0,16 мм, неподвижная фаза 5% SE-30.

Температура: термостата колонки — 190 °С;

термостата испарителя — 220 °С;

детектора — 230 °С.

Скорость газа-носителя — азота (через колонку) — 60 мл/мин.

Поддув в детектор — 160 мл/мин.

Объем, вводимый в испаритель, — 5 мкл.

Линейность детектирования — 0,25 — 5 нг.

Время удерживания относительно альдрина — 0,68. -10

Рабочая шкала электрометра — 5 х 10 .

Скорость движения ленты самописца — 5 мм/мин.

Альтернативные условия

Колонка стеклянная спиральная, длина 2 м, внутренний диаметр 3 мм.

Носитель Хроматон-N-AW-DMCS, размер частиц 0,125 — 0,16 мм, неподвижная фаза 1,5 % OV-17 + 1,95% QF-1.

Температура: термостата колонки — 190 °С;

термостата испарителя — 220 °С;

детектора — 230 °С.

2.6.1.3 Метод капиллярной ГЖХ

Хроматограф «Кристалл 2000» с детектором по захвату электронов и ДВК-3.

Колонка капиллярная кварцевая, длина 25 м, внутренний диаметр 0,2 мм, жидкая фаза OV-1.

Режим работы хроматографа — нормальный.

Температура термостата колонки — 175 °С.

Температура испарителя — 250 °С, детектора — 250 °С.

    Газовый  режим:  газ-носитель,   азот  (Г  и Г ), общий расход
                                             1    2
азота  -  30  мл/мин.,  расход  на  колонке - 0,5 мл/мин.; газ для

поддува в детектор (Г ) — азот, расход — 20 мл/мин. 3

Относительное время удерживания Кломазона по отношению к альдрину 0,81.

Объем вводимой пробы — 1 мкл.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют.

2.6.1.4 Метод ТСХ

Пробу 0,1 мл количественно наносят при помощи капиллярной пипетки на хроматографическую пластинку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Центр пятна должен быть на расстоянии 2 см от края пластинки. Колбу с экстрактом обмывают порциями ацетона, который также наносят в центр пятна. Справа и слева наносят серию стандартных растворов Кломазона, содержащих 0,5, 2 и 5 мкг вещества.

Пластинку помещают в хроматографическую камеру, содержащую подвижную фазу: н-гексан:ацетон в соотношении 4:1 (время насыщения камеры 30 мин.). После подъема фронт подвижной фазы на 15 — 17 см пластинку извлекают из камеры, подсушивают и обрабатывают проявляющим раствором.

Пластинки для тонкослойной хроматографии:

«Силуфол», размер 200 х 200 мм, R — 0,35; f.

«Пластинки для ВЭТСХ», Россия, R — 0,85; f.

«Алюграм», Германия, R — 0,37; f.

«Полиграм», Германия, R — 0,38; f.

«Кизельгель 69F — 254», R — 0,43. f.

Подвижная фаза: хлороформ:ацетон в соотношении 9:1.

Проявляющий раствор — раствор азотнокислого серебра.

Облучение УФ-светом.

Нижний предел обнаружения — 0,5 мкг.

2.6.2 Обработка результатов анализов

2.6.2.1 Методы ГЖХ и ВЭЖХ

Содержание Кломазона в пробах воды, почвы, зерна, соломы риса, семенах и масле сои при анализе методом ГЖХ и ВЭЖХ рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                      Н  х А х V х D
                       1

Х = -------------- х Р, Н х m х 100 0

где:
Х - содержание Кломазона в пробе, мг/кг;
Н  - высота пика образца, мм;
 1
Н  - высота пика стандарта, мм;
 0
А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;
V  -  объем экстракта, подготовленного для хроматографирования

(мл); m — масса или объем анализируемого образца, г или мл; Р — содержание Кломазона в аналитическом стандарте;

    D   -  коэффициент  пересчета,  учитывающий  отбор  половинной
аликвоты  из  фильтрата  после  первичной  экстракции, равен 2 для

почвы.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией Кломазона 1,0 мкг/мл, разбавляют.

2.6.2.2 Метод ТСХ

Содержание Кломазона в пробах при анализе методом ТСХ рассчитывают по формуле:

                              А

                              Р

где:

А — количество Кломазона, найденное на хроматограмме при сравнении со стандартом, мкг;

Р — навеска пробы, г.

3. Требования к технике безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами и электронагревательными приборами.

4. Разработчики

Клисенко М.А., докт. биол. наук, профессор; Демченко В.Ф., м. н. сотр., Давидюк Е.И., инж., ВНИИГИНТОКС, лаборатория аналитической химии, г. Киев, Республика Украина.

Семена сои — ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ.

Спиридонов Ю.Я., зав. отделом гербологии ВНИИФ, чл. — корр. РАСХН, докт. биол. наук профессор; Ларина Г.Е., ст. науч. сотр., канд. биол. наук.

---