МУК 4.1.1455-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств клефоксидима в воде, почве, зерне и соломе риса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 24.06.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КЛЕФОКСИДИМА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ РИСА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.1455-03

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: БАСФ АГ, Германия.

Торговое название: АУРА.

Действующее вещество: клефоксидим (BAS 625 Н).

2-[1-(2-(4-хлорфенокси)пропоксиимино)-бутил]-3-оксо-5-тиан-3-илциклогекс-1-енол (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

    Эмпирическая формула: C  H  ClNO S.
                           24 32    4

Молекулярная масса: 466,04.

Бесцветная вязкая жидкость.

Температура плавления: 185 °С (с разложением).

Давление паров при 25 °С: <...>

Коэффициент распределения н-октанол/вода: log P = <...>

Растворимость (г/л) при 20 град. С: ацетон и этилацетат — более 700, 2-пропанол — 330, этанол — 67, вода — 5,3 мг/л.

Стабильность к гидролизу при 25 град. С (в темноте): DT = менее 1 часа (рН 5), 140 дней (рН 7) и более 300 дней (рН 9).

Вещество стабильно при нормальных условиях хранения.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — более 5000 50 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс — более 4000 50 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC ) для крыс — более 50

5,2  мг/куб.  дм  воздуха.  Вещество  не  оказывает  раздражающего
действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика. LC   для рыб -

                                                  50

12,8 мг/куб. дм (96 час.).

Клефоксидим не токсичен для пчел, птиц и диких животных. Гигиенические регламенты применения вещества в России не установлены.

Область применения препарата:

Клефоксидим — гербицид системного действия из группы ингибиторов биосинтеза жирных кислот. Он быстро проникает в листья и корни вегетирующих растений и передвигается в точки роста. Предназначен для уничтожения однолетних и многолетних злаковых сорных растений в посевах риса, независимо от способа его выращивания. Применяется для обработки в период от фазы 2 — 3 листьев до конца кущения у злаковых сорняков (рис при этом должен иметь не менее 3 листьев).

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Аура (BAS 525 Н) (концентрат эмульсии, содержащий 75 г клефоксидима в 1 л препарата) на рисе в качестве избирательного гербицида при норме расхода препарата до 2,7 л/га.

2. Методика определения остаточных количеств клефоксидима в воде, почве, зерне и соломе риса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении клефоксидима методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из воды хлористым метиленом, из почвы и растительного материала — ацетоном, очистки экстрактов перерастворением в хлористом метилене и на концентрирующих патронах-колонках Диапак-диол и Диадак-амин.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания риса.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/куб. дм, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/куб. дм, мг/кг	Среднее значение определения, %	Стандартное отклонение S, %	Относит. стандартное отклонение DS, %	Доверительный интервал среднего, %, +/-
Вода Почва Зерно Солома	0,002 0,02 0,05 0,10	0,002 — 0,02 0,02 — 0,2 0,05 — 0,5 0,10 — 1,0	81,2 80,4 79,2 87,4	4,7 5,0 4,8 5,4	2,1 2,2 2,2 2,4	+/- 4,4 +/- 4,6 +/- 4,5 +/- 5,0

Матрица	Внесено мг/куб. дм, мг/кг	Открыто %	Доверительный интервал среднего результата, %
Вода	0,002 0,004 0,010 0,020	78,4 80,6 81,8 84,0	+/- 4,7 +/- 5,0 +/- 5,5 +/- 3,2
Почва	0,02 0,04 0,10 0,20	76,5 80,6 81,4 83,9	+/- 5,5 +/- 4,3 +/- 4,1 +/- 2,7
Зерно	0,05 0,10 0,20 0,50	77,1 80,0 78,3 81,4	+/- 6,9 +/- 4,7 +/- 5,0 +/- 3,5
Солома	0,10 0,20 0,50 1,0	82,8 87,1 89,1 90,7	+/- 6,9 +/- 4,5 +/- 3,9 +/- 2,2

2.2. Реактивы, растворы и материалы

Клефоксидим с содержанием д.в. 98,8% (БАСФ, Германия).

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-82.

Вода дистиллированная или деионизованная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Концентрирующие патроны Диапак-диол, АО БиоХимМак (117899, Москва, Воробьевы горы, МГУ), ТУ 4215-002-05451931-94.

Концентрирующие патроны Диапак-амин, АО БиоХимМак (117899, Москва, Воробьевы горы, МГУ), ТУ 4215-002-05451931-94.

Метилен хлористый, ГОСТ 12794-80.

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4156-76.

Спирт метиловый, х.ч., ГОСТ 6995-77.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил — вода (85:15, по объему).

Элюент для Диапак-диола: смесь гексан:хлористый метилен (1:1, по объему).

Фильтры бумажные синяя лента, ТУ 6-09-1678.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный.

Самописец регистрирующий фирмы Kipp. a. Zonen BD 41 или аналогичный.

Колонка хроматографическая длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-С15 Т или Диасорбом 130-С8 Т зернением 7 мкм (АО БиоХимМак; Москва, Воробьевы горы, МГУ).

Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф емкостью 100 мкл.

Медицинский шприц с разъемом типа Люер для ввода образцов в концентрирующий патрон Диапак.

Аппарат для встряхивания АВУ, ТУ 64-1-1081-83.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.

Водоструйный насос, ГОСТ 10695-75.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 45-22-236-79, или аналогичная.

Прибор для перегонки при атмосферном давлении.

Ротационный испаритель, тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.

Воронка Бунзена, ГОСТ 0147-73.

Воронки для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные вместимостью 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные вместимостью 50, 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2 и 5 мл, ГОСТ 20292-74Е.

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100 и 250 мл, ГОСТ 1770-74.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).»

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 град. С не более 3 месяцев. Пробы почвы высушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния и хранят в стеклянной емкости в холодильнике не более 3 месяцев. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 град. С в течение 2 дней, при температуре -18 град. С в течение месяца.

Перед анализом зерно и солому размалывают на мельнице, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

    Ацетон  перегоняют  над  перманганатом калия и поташом (на 1 л
ацетона 10 г KMnO  и 2 г и 2 г K CO ).
                 4              2  3

Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2 Подготовка подвижной фазы ВЭЖХ

Отмеряют 850 мл ацетонитрила, переносят в мерную колбу на 1000 мл, добавляют 150 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

2.5.3 Кондиционирование колонки и концентрирующих патронов

Промыть колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил — вода (85:15, по объему) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линии (5 — 15 минут).

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 мл хлористого метилена и 6 мл смеси гексан — хлористый метилен (1:1, по объему), а патрон Диапак-амин — 10 мл ацетона и 6 мл смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) со скоростью 5 мл/мин.

2.5.4 Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор клефоксидима с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 98,8% д.в., в метаноле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные раствора с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора клефоксидима соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы готовятся и используются в день анализа.

2.5.5 Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора клефоксидима с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации клефоксидима в растворе в мкг/мл.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения клефоксидима на концентрирующих патронах-колонках Диапак

2.5.6.1 Диапак-диол

В грушевидную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора клефоксидима с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 мл смеси гексан — хлористый метилен (1:1, по объему) и наносят на кондиционированный патрон. Промывают патрон 5 мл этой же смеси со скоростью 1 мл/мин. Отбирают фракции по 1 мл каждая, упаривают растворитель, остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

Фракции, содержащие клефоксидим, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание клефоксидима в элюате, определяют полноту вымывания вещества из патрона.

2.5.6.2 Диапак-амин

В грушевидную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора клефоксидима с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 мл смеси гексан — ацетон (8:2, по объему) и наносят на кондиционированный патрон. Промывают патрон 4 мл смеси гексан — ацетон (8:2) и затем 12 мл ацетона со скоростью 1 мл/мин. Отбирают фракции по 1 мл каждая, упаривают растворитель, остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

Фракции, содержащие клефоксидим, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание клефоксидима в элюате, определяют полноту вымывания вещества из патрона.

Примечание: Профиль вымывания клефоксидима может меняться при использовании новой партии патронов-колонок Диапак и растворителей.

2.6. Описание определения

2.6.1 Экстракция клефоксидима

2.6.1.1. Вода. 100 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 30 мл при энергичном встряхивании в течение 1 минуты. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

2.6.1.2. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают н коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл ацетона и суспензию перемешивают в течение 40 минут на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Почву повторно экстрагируют 50 мл ацетона при встряхивании в течение 20 минут и суспензию фильтруют. Из объединенного фильтрата отбирают четвертую часть объема (около 35 мл) раствора, эквивалентную 5 г почвы, и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.2.

2.6.1.3. Зерно, солома. Навеску размолотого зерна (10 г) или соломы (5 г) помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 50 мл ацетона и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок переносят в колбу, приливают 50 мл ацетона и повторно перемешивают 30 минут на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр и из объединенного фильтрата отбирают пятую часть объема (около 20 мл) раствора, эквивалентную соответственно 2 г зерна и 1 г соломы. Растворы упаривают досуха на роторном испарителе при 30 град. С и остатки очищают по п. 2.6.2.

2.6.2 Очистка на патронах Диапак

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 2.6.1.2 или 2.6.1.3, растворяют двумя 10 мл порциями хлористого метилена и раствор переносят в грушевидную колбу емкостью 50 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси гексан — хлористый метилен (1:1, по объему) и раствор наносят на кондиционированный патрон Диапак-диол (п. 2.5.3), который затем промывают 5 мл этой же смеси со скоростью 1 мл/мин. Элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 25 мл и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Остаток переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) в подготовленный патрон Диапак-амин (п. 2.5.3) и промывают 4 мл этой же смеси, которые отбрасывают. Клефоксидим элюируют из патрона 12 мл ацетона со скоростью 1 мл/мин. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Сухой остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

Примечание: При использовании новой партии патронов Диапак или растворителей проводится проверка хроматографического поведения клефоксидима на патронах Диапак-диол и Диапак-амин.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Aitex (США) или аналогичный.

Самописец регистрирующий фирмы Kipp. a. Zonen BD 41 или аналогичный.

Хроматографическая колонка длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасорб 130-С16 Т6 зернением 7 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза ацетонитрил — вода (85:15, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 мл/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм.

Чувствительность детектора: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Скорость протяжки ленты самописца: 10 см/час.

Время выхода клефоксидима: около 6 мин.

Линейный диапазон детектирования: 5 — 50 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С8 Т.

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (85:15, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 мл/мин.

Время выхода клефоксидима: 4,8 мин.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание клефоксидима рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                         Н  х А х V
                          1

                        Х =  ----------,
                               Н  х m

                            0

где:
Х - содержание клефоксидима в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;
Н  - высота пика образца, мм;
 1
Н  - высота пика стандарта, мм;
 0
А - концентрация стандартного раствора клефоксидима, мкг/мл.
V  - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования,

мл;

    m  -  масса  или  объем анализируемого образца, г или мл  (для
воды  -  100  мл; для почвы - 5 г; для зерна - 2 г; для соломы - 1

г).

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

4. Разработчики

Дубовая Л. В., научный сотр.; Макеев А.М., зав. лабораторией, канд. биол. наук.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-86.

---