МУК 4.1.1454-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств имазамокса в воде, почве, зерне и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 24.06.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМАЗАМОКСА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЗЕРНЕ И МАСЛЕ СОИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.1454-03

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: БАСФ.

Торговое название: Пульсар.

Название действующего вещества по ИСО: имазамокс.

Синонимы: отсутствуют.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-5-метоксиметил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил) никотиновая кислота.

Структурная формула: (не приводится).

Назначение препарата

В нашей стране препарат Пульсар (4% к.с.) проходит предварительные регистрационные испытания в качестве гербицида для подавления осок, широколистных и злаковых сорняков в посевах некоторых бобовых культур (гороха и сои) в ранний послевсходовый период до стадии цветения. Рекомендуемая фирмой-производителем «Цианамид» (США) эффективная норма расхода при опрыскивании составляет 25 — 45 г/га по д.в. в зависимости от культуры, условий и способов применения. Подавление сорняков происходит благодаря поглощению гербицида листьями и/или корневой системой сорняков и быстрому перемещению в точки роста.

2. Методические указания по определению остаточных количеств имазамокса в почве, воде, зерне и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Физико-химические свойства действующего вещества препарата Пульсар

Фирма-производитель: «Цианамид» (США);

торговое название препарата: Пульсар;

название действующего вещества по ИСО: имазамокс;

название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-5-метоксиметил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил) никотиновая кислота;

структурная формула: (не приводится).

Физико-химические свойства имазамокса

эмпирическая формула: C H № O ; 15 19 3 4

молекулярная масса: 305,3;

агрегатное состояние: кристаллическое вещество;

цвет: бесцветные кристаллы, без запаха;

температура плавления: 166,0 — 166,7 °С; -2

летучесть (давление паров): < 1,3 х 10 мПа (при 20 °С);

растворимость в воде при 25 °С: 4160,0 мг/л;

растворимость в органических растворителях при 20 °С (г/л): ацетон — 30,9; метилен хлористый — 218,0; н-гексан — 0,007; толуол — 2,2; метанол — 67,5; ацетонитрил — 19,0;

    коэффициент распределения в системе  октанол/вода  при  25 °С:
К   log P  =  -1,03 (рН  5,  без коррекции на  диссоциацию), - 2,4

wo (рН 7, без коррекции на диссоциацию), 0,73 (рН 5-6, с коррекцией на диссоциацию).

Устойчивость: разлагается при 175 °С и выше (техн. продукт), в нормальных условиях сохраняется без изменений длительное время, но быстро разлагается на свету.

Период полуразложения в дерново-подзолистой почве: 32 — 39 сут.

3. Краткая гигиеническая характеристика действующего вещества и препаративной формы

    Имазамокс   относится   к  малотоксичным  веществам:  оральная
ЛД   (крысы) >  5000 мг/кг, кожно-резорбтивная ЛД   (крысы) > 4000
  50                                             50
мг/кг.  Ингаляционная токсичность ЛК    (крысы, 4 час.) более 6,30

                                50

мг/л воздуха,  ЛД    (перепелка,  14 сут.)  >  1846  мг/кг,   ЛК
                 50                                             50

(радужная форель, 96 ч) > 122 мг/л, NOEC (дафния) = 122 мг/л, ЛД 50 (пчелы) > 25 мкг/особь (контактно).

В России проводятся работы по установлению гигиенических нормативов.

4. Метод определения действующего вещества кломазона в масле сои

Метод основан на извлечении имазамокса из воды и почвенных проб — 0,1н водным раствором соляной кислоты, из зерна сои — этиловым эфиром уксусной кислоты, из масла сои — 0,1н NaOH, очистке полученных экстрактов путем промывания с несмешивающимся с водой растворителем — н-гексаном и переэкстракции в метилен хлористый с последующим определением имазамокса методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора при длине волны 254 нм (подробно метод описан в Приложении).

Приложение

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (ВЭЖХ)

1. Основные положения

1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении имазамокса из воды и почвенных проб — 0,1н водным раствором соляной кислоты, из зерна сои — этиловым эфиром уксусной кислоты, из масла сои — 0,1н NaOH, очистке полученных экстрактов путем промывания с несмешивающимся с водой растворителем — н-гексаном и переэкстракции в метилен хлористый с последующим определением имазамокса методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора при длине волны 254 нм.

Минимально детектируемое количество имазамокса — 10 нг.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен и может применяться для определения остаточных количеств имазамокса в воде, почве и растительном материале сои (зерно и масло) в присутствии других пестицидов.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 — 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Таблица 2

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

2.2.1 Реактивы, материалы и растворы

Имазамокс аналитический стандарт с содержанием 99,8% д.в., производство фирмы «Цианамид»;

ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83;

вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72;

н-гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78;

натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77;

кальций хлористый, обезвоженный, х.ч., ГОСТ 4233-77;

соляная кислота, х.ч., ГОСТ 3118-77;

этиловый эфир уксусной кислоты, х.ч., ГОСТ 22300-76;

уксусная кислота, х.ч., ГОСТ 61-75;

метилен хлористый, х.ч., ТУ 6-09-2662-77;

метанол, х.ч., ТУ 6-09-11-1643-82;

натр едкий, ч.д.а., ГОСТ 4328-77, 20%-ный раствор;

натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76;

фосфора оксид (V), х.ч., ТУ 6-09-4173-85;

стандартный раствор имазамокса в ацетоне — 100 мкг/мл (хранить в холодильнике, срок годности 60 сут.).

2.2.2 Приборы, аппаратура, посуда

Высокоэффективный жидкостный хроматограф «Altex» с ультрафиолетовым детектором «Spectroflow 757» или другой аналогичного типа;

стальная колонка для ВЭЖХ Ultrasphere ODS (4,6 x 250 мм), 5 мкм;

самописец, модель ВД40 Kipp & Zonen или другой аналогичного типа;

аппарат для встряхивания проб АВУ-1, ТУ 64-1-1081-7, или другой аналогичного типа;

испаритель ротационный Rotavapor R110 Buchi или ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, с водяной баней или другой аналогичного типа;

весы аналитические FX-40 A & D Company, АД-20, ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или другие аналогичного типа;

весы лабораторные технические ВЛТК-500 или другие аналогичного типа;

иономер, модель И-135, ТЗАН или другой аналогичного типа;

воронки химические, ГОСТ 25336-82Е;

воронки делительные на 250 мл, ГОСТ 10054-75;

воронки Бюхнера, ГОСТ 9147-80;

колбы конические плоскодонные вместимостью 250 и 500 мл, ГОСТ 10394-72;

колбы мерные вместимостью 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74;

колбы Бунзена, ГОСТ 6514-74;

колбы грушевидные (концентраторы), ГОСТ 10394-74;

мельница (для размола зерна сои);

микропипетки (для нанесения растворов) вместимостью 0,1 — 0,2 мл, ГОСТ 20292-74;

микрошприцы Гамильтон вместимостью 100 мкл или другие аналогичного типа;

палочки стеклянные;

пипетка цифровая автоматическая с максимальной емкостью 5 мл, Aldrich, Wheaton или другая аналогичного типа.

2.3. Подготовка к определению

2.3.1 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В колбу на 1000 мл вносят 190 мл ацетонитрила, добавляют 800 мл бидистиллированной воды и 10 мл уксусной кислоты. Полученный раствор ацетонитрил:вода:уксусная кислота (19:80:1, по объему) фильтруют и дегазируют.

2.3.2 Кондиционирование колонки

Промывают колонку для ВЭЖХ системой ацетонитрил:вода:уксусная кислота (19:80:1, по объему) в течение 30 мин. при скорости подачи подвижной фазы 1,5 мл/мин. Включают детектор, ожидают стабилизацию базовой линии (10 — 20 мин.).

2.3.3 Приготовление рабочих растворов

2.3.3.1 Приготовление 0,024 н раствора соляной кислоты

2 мл HCl переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют (конц) 600 — 700 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения вещества и доводят водой до метки.

2.3.3.2 Приготовление 0,1 н раствора соляной кислоты

8,4 мл HCl переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют (конц) 600 — 700 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения вещества и доводят водой до метки.

2.3.3.3 Приготовление 1 н раствора соляной кислоты

84 мл HCl переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют (конц) 600 — 700 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения вещества и доводят водой до метки.

2.3.3.4 Приготовление 0,1 н раствора едкого натра

4 г сухого NaOH (в таблетках) вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют 600 — 700 мл бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения вещества и доводят водой до метки.

2.3.3.5 Приготовление раствора «А»

50 мл метанола вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют 600 — 700 мл 0,024 н раствора соляной кислоты, перемешивают до полного растворения вещества и доводят 0,024 н раствором соляной кислоты до метки.

2.3.4 Приготовление стандартных растворов

0,01 г имазамокса (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор № 1, концентрация 100 мкг/мл). Раствор хранится в холодильнике не более 60 сут.

Методом последовательного разбавления исходного стандарта № 1 раствором «А» готовят рабочие растворы имазамокса — 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/мл (рис. 1 — здесь и далее рисунки не приводятся), которые могут храниться при комнатной температуре не более 14 сут.

2.3.5 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 100 мкл рабочего раствора имазамокса с концентрацией 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/мл. Проводят не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации имазамокса в растворе в мкг/мл (рис. 2).

2.4. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными Минздравом СССР от 21.08.79 № 2051-79.

Пробы воды в стеклянной или полиэтиленовой таре хранят при температуре 0 — 4 °С в течение не более 7 суток, для более длительного хранения пробы замораживаются и хранятся при -18 °С. Отобранные пробы зерна сои подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при температуре 0 — 4 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение 6 месяцев. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно сои измельчают на лабораторной мельнице.

2.5. Проведение определения

2.5.1 Экстракция гербицида из анализируемой пробы

2.5.1.1 Вода

Образец воды объемом 500 мл фильтруют через двойной складчатый фильтр «синяя лента», подкисляют 0,1 н HCl до рН 1,5 — 2,0 (добавляют около 50 мл) и помещают в делительную воронку на 1000 мл и промывают н-гексаном 3 х 50 мл, н-гексан отбрасывают. Экстракцию имазамокса из воды проводят метиленом хлористым 3 х 50 мл. Экстракты объединяют, пропускают через слой безводного сульфата натрия и выпаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл раствора «А» и хроматографируют. Типичные хроматограммы имазамокса, внесенного в воду, представлены на рис. 3 — 4.

2.5.1.2 Почва

100 г почвы (в пересчете на воздушно-сухую) помещают в коническую колбу на 500 мл, добавляют 0,5 г CaCl , заливают 100 мл 2

0,1 н HCl  и  экстрагируют имазамокс в течение 30 мин. на аппарате
для  встряхивания.  Смесь отстаивают в течение 10 мин. и фильтруют

через двойной складчатый фильтр «синяя лента». Процедуру повторяют

со 100 мл 0,1 н HCl. В колбу с оставшейся  почвой  доливают  20 мл
0,1 н HCl, тщательно перемешивают до образования однородной  массы
и декантируют  через  воронку  с  тем  же  двойным  фильтром.   Из
фильтрата отбирают аликвоту,  равную  половине  исходного  объема,

т.е. 110 мл.

Аликвоту помещают в делительную воронку вместимостью 250 мл и промывают водный экстракт н-гексаном 3 х 15 мл. Гексановый слой отбрасывают и экстрагируют имазамокс метиленом хлористым 3 х 15 мл. Объединенные экстракты пропускают через воронку с 3 г безводного сульфата натрия на фильтре «красная лента» и собирают в концентратор вместимостью 100 мл. При температуре водяной бани 40 °С выпаривают метилен хлористый на вакуумном ротационном испарителе до сухого остатка. Далее процедура анализа аналогична схеме, приведенной в п. 2.5.1.1. Типичные хроматограммы имазамокса, внесенного в почву, представлены на рис. 5 — 8.

2.5.1.3 Зерно сои

Навеску зерна сои, измельченную в порошок на электрической мельнице, массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл. Приливают 50 мл этилового эфира уксусной кислоты и экстрагируют при перемешивании 30 мин., операцию повторяют. Экстракты фильтруют в колбу вместимостью 250 мл через слой безводного сульфата натрия, помещенного на двойной складчатый фильтр «синяя лента». Затем фильтр с осадком промывают 2 х 20 мл 0,1 н HCl. Объединенный фильтрат переносят в колбу — концентратор и при температуре 60 °С выпаривают этиловый эфир уксусной кислоты, используя вакуумный ротационный испаритель. Водный раствор из концентратора переносят в делительную воронку вместимостью 250 мл и промывают 3 х 10 мл н-гексаном. Гексановые экстракты отбрасывают. Экстракцию имазамокса из водной фазы проводят метиленом хлористым 3 х 50 мл. Для лучшего разделения в воронку добавляют 2 мл насыщенного водного раствора NaCl. Экстракты объединяют, пропускают через помещенный на фильтр слой безводного сульфата натрия и выпаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С досуха. Далее процедура анализа аналогична схеме проведения в п. 2.5.1.1. Типичные хроматограммы имазамокса, внесенного в зерно сои, представлены на рис. 11 — 12.

2.5.1.4 Масло сои

    Навеску  масла  сои  (10 мл) помещают в колбу вместимостью 500
мл,  приливают  50  мл  н-гексана  и  оставляют  на  30 мин. Далее
приливают  150  мл 0,1 н  NaOH и перемешивают в течение 30 мин. на
аппарате  для  встряхивания. Образовавшиеся хлопья отфильтровывают
через   бумажный   фильтр  "синяя  лента"  в  делительную  воронку
вместимостью  500  мл. Фильтрат трижды порциями по 10 мл промывают

н-гексаном. Гексановый слой отбрасывают. Фильтрат подкисляют 0,1 н

HCl  до  рН  2  и  экстрагируют  метиленом  хлористым  3  х 20 мл.
Объединенный  экстракт  осушают,  пропуская раствор через бумажный
фильтр  со  слоем  Na SO       , и  упаривают  досуха на вакуумном
                     2  4(безв)
ротационном  испарителе  при температуре водяной бани 40 °С. Далее

процедура анализа имазамокса в масле сои аналогична описанной выше в п. 2.5.1.1. Типичные хроматограммы имазамокса, внесенного в масло сои, представлены на рис. 9 — 10.

Условия хроматографирования

Высокоэффективный жидкостный хроматограф «ALTEX» с УФ-детектором:

• стальная колонка для ВЭЖХ Ultrasphere ODS (4,6 х 250 мм), 5 мкм;
• подвижная фаза — ацетонитрил + вода + 1%-ный водный раствор уксусной кислоты (19 + 80 + 1 по объему);
• расход подвижной фазы — 1,5 мл/мин.;
• длина волны УФ-детектора — 254 нм;
• аттеньюация — 0,01 — 0,02 ед. абсорбции на шкалу;
• вводимый объем пробы — 100 мкл;
• время удержания имазамокса — 4 мин. 50 сек.;
• минимально детектируемое количество имазамокса в анализируемом объеме — 10 нг;

Количественное определение имазамокса проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов имазамокса с концентрацией 0,05 — 0,50 мкг/мл.

Обработка результатов анализов

Для определения содержания имазамокса в пробах методом ВЭЖХ использовали следующую формулу:

                               h   х С   х V
                                об    ст    0
                         С   = -------------- х Р,
                          об      h   х m
                                   ст    n

где:
С   - содержание имазамокса в пробе, мг/кг (л);
 об
С   -    количество   стандарта   имазамокса,   введенного   в
 ст

хроматограф, мкг/мл; h — высота хроматографического пика стандарта имазамокса, ст мм; h — высота хроматографического пика имазамокса в пробе, мм; об V — конечный объем анализируемого образца, мл; 0 Р — коэффициент пересчета, учитывающий отбор половинной аликвоты из фильтрата после первичной экстракции, равный 2;

m  - навеска (объем) анализируемого образца, г (мл).

 n

Требования к технике безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе в химической лаборатории с органическими растворителями, токсичными веществами и электронагревательными приборами.

Разработчики

Спиридонов Ю.Я., зав. отделом гербологии ВНИИФ, чл.-корр. РАСХН, докт. биол. наук, профессор; Жемчужин С.Г., руководитель аналит. группы, докт. хим. наук; Ларина Г.Е., ст. науч. сотр., канд. биол. наук; Захаров С.А., мл. науч. сотр.; Захарова Т.В., лаборант-исследователь.

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии, отдел гербологии. Вода, почва, зерно, масло сои (ВЭЖХ), 2000 г.