МУК 4.1.1448-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств диниконазола в семенах и масле подсолнечника методом газожидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 24.06.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДИНИКОНАЗОЛА В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.1448-03

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом — МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: Август.

Торговое наименование: ВИАЛ.

Действующее вещество: диниконазол М (ISO).

Структурная формула: (не приводится).

(Е)-(R)-1-(2,4-дихлорфенил)-4,4-диметил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)пент-1-ен-3-ол(IUPAC).

    Брутто формула: C  H  Cl N O.
                     15 17  2 3

Мол. масса: 326,2.

Химически чистый препарат — бесцветное кристаллическое вещество.

Температура плавления: 134 — 156 °С.

Давление паров при 20 °С — 2,93, при 25 °С — 4,9 mPa.

Коэффициент распределения н-октанол/вода: К log Р = 4,3 (25 ow °С).

Растворимость в воде при 25 °С — 4 мг/л;

в н-гексане — 0,7, ксилоле — 14, метаноле и ацетоне — 95 (в г/кг при 25 °С).

Вещество стабильно на свету при повышенной температуре и влажности.

Класс токсичности по ВОЗ — III, ЕПА — III.

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 639 мг/кг, 50 дермальная — 5000 мг/кг.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ПДК в воде водоемов (мг/куб. дм) — 0,004,

ПДК в почве (мг/кг) — не нормирован,

МДУ в продукции (мг/кг):

Зерно хлебных злаков — 0,05.

Область применения: фунгицид для борьбы с мучнистой росой, паршой, ржавчиной и др. заболеваниями виноградной лозы, зерновых, сахарной свеклы, плодовых, овощных и масличных культур. Используется как протравитель семян на зерновых.

2. Методика определения диниконазола М в семенах и масле подсолнечника методом газожидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на извлечении диниконазола М из семян и масла подсолнечника водно-ацетоновым раствором или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями и на колонке с флорисилом. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора.

2.1.2 Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб и сочетанием условий хроматографирования. Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Объект анализа	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Среднее значение определения, % (для каждого объекта, n = 24)	Относительное стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего, n = 24, Р = 0,95
Семена	0,01	0,01 — 0,1	78,0	5,6	4,8
Масло	0,02	0,02 — 0,2	79,1	6,4	5,9

Среда	Внесено, мг/кг	Найдено, мг/кг	Стандартное отклонение, S, мг/кг	Доверительный интервал (Р = 0,95, n = 6), %	Полнота определения, %
Семена	0,01	0,0075	-4 8,2 х 10	6,01	75,0
	0,02	0,0171	-3 1,5 х 10	5,23	78,3
	0,05	0,040	-3 3,7 х 10	6,10	80,0
	0,1	0,079	-3 6,3 х 10	5,17	78,7
Среднее					78,0
Масло	0,02	0,0165	-3 1,4 х 10	6,71	82,6
	0,05	0,0375	-3 3,4 х 10	6,68	75,0
	0,1	0,0797	-3 7,3 х 10	6,21	79,7
	0,2	0,1583	-2 1,3 х 10	6,10	79,2
Среднее					79,1

2.2. Реактивы и материалы

Аналитический стандарт диниконазола 99,8%.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Азот газообразный в баллонах с редуктором, ТУ-6-16-40-14-88.

Бумажные фильтры «красная лента», ТУ 6.091678-86.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Стекловата.

Флорисил 150 — 250 мю m (Merck, Германия), содержание воды <= 2,5%.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Хлороформ, ч.д.а., ТУ-2631-020-11291058-96.

Насадка для колонки: хроматон N-Super (0,125 — 0,160 мм) с 5% SE-30 (Чехия).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Элюент для колоночной хроматографии № 1: гексан-этилацетат (50:50, по объему).

Элюент для колоночной хроматографии № 2: гексан-этилацетат (20:80, по объему).

2.3. Приборы и посуда

Газовый хроматограф Цвет-550 М или аналогичный с ДЭЗ (ДПР) и стеклянной насадочной колонкой длиной 1 м; внутренним диаметром 3 мм.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Весы технические ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Установка ультразвуковая «Серьга», ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Микрошприц МШ-10, МШ-10М, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Стаканы химические, ГОСТ 25336-82Е.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 25 см, диаметром 10 мм.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Для длительного хранения пробы семян подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян подсолнечника измельчают на лабораторной мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

    Органические  растворители перед началом работы очищают, сушат
и  перегоняют  в  соответствии  с общепринятыми методиками. Ацетон
перегоняют  над перманганатом калия и поташем (на 1 л ацетона 10 г
KM O   и  2 г  K CO ). Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и
  n 4           2  3
перегоняют;   отогнанный   растворитель  повторно  перегоняют  над
углекислым  калием.  Этилацетат  промывают  равным объемом 5%-ного
раствора  двууглекислого  натрия,  сушат  над хлористым кальцием и

перегоняют.

2.5.2 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125 — 0,160 мм) с 5% SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С в течение 8 — 10 часов.

2.5.3 Приготовление стандартного и градуировочных растворов.

Берут точную навеску диниконазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя для разбавления гексан. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы — в течение недели.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют градуировочные растворы.

2.5.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация диниконазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации диниконазола в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5 Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты и вносят суспензию 4 г флорисила в 20 мл смеси гексан:этилацетат (1:1, по объему), дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 20 мл этой же смеси со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6 Проверка хроматографического поведения диниконазола на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,5 мл стандартного раствора диниконазола с концентрацией 1 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 мл элюента № 1 и вносят в колонку. Колбу обмывают еще 2 мл элюента № 1 и также вносят в колонку. Затем промывают колонку 20 мл гексана и элюируют диниконазол 50 мл элюента № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл гексана и анализируют на содержание диниконазола по п. 2.6.4. Фракции, содержащие диниконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл гексана и анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание диниконазола в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: профиль вымывания диниконазола может меняться при использовании новой партии сорбента.

2.5.7 Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1 Экстракция диниконазола из семян подсолнечника

Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают 50 — 100 мл смеси растворителей ацетон — вода (в соотношении 1:1) и экстрагируют диниконазол в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр («красная лента»). Экстракцию повторяют дважды 30 мл той же смеси. Объединенный фильтрат помещают в делительную воронку и переэкстрагируют диниконазол хлороформом трижды порциями по 30 мл. Объединенные хлороформные экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 50 °С до полного удаления хлороформа. Далее проводят очистку экстрактов по п. 2.6.3.

2.6.2 Экстракция диниконазола из масла подсолнечника

Навеску масла 10 г растворяют в 50 мл гексана и экстрагируют диниконазол 50 мл ацетонитрила в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученную смесь помещают в делительную воронку объемом 250 мл. После расслоения <*> нижний ацетонитрильный слой сливают, из верхнего гексанового слоя экстрагируют диниконазол ацетонитрилом еще дважды порциями по 25 мл. К объединенному ацетонитрильному экстракту добавляют воду в соотношении ацетонитрила:вода = 1:4 и переэкстрагируют диниконазол хлороформом трижды порциями по 30 мл. Объединенные хлороформные экстракты сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона и помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С на 2 часа. Охлажденный ацетоновый раствор декантируют в круглодонную колбу на 10 мл через фильтр «красная лента», после чего фильтр промывают 2 мл ацетона. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Далее очистку проводят по п. 2.6.3.

---

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий можно добавить несколько мл насыщенного раствора хлористого натрия.

2.6.3 Очистка экстрактов на колонке с флорисилом

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. п. 2.6.1 и 2.6.2 экстрактов семян или масла, количественно переносят двумя порциями по 2 мл смеси гексан — этилацетат (1:1, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 20 мл гексана, которые отбрасывают. Диниконазол элюируют 50 мл элюента № 2 (гексан — этилацетат = 2:8). Весь элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С. Сухой остаток растворяют в 1 — 2 мл гексана и 1 мкл раствора вводят в хроматограф.

2.6.4 Условия хроматографирования

Газовый хроматограф «Цвет-550 М» с ДПР (ДЭЗ) или аналогичный.

1. Колонка стеклянная 1 м х 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 — 0,160 мм) с 5% SE-30.

Температура колонки 230 °С, испарителя — 240 °С, детектора — 320 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 45 куб. см/мин. 10

Шкала электрометра 8 х 10 .

Объем вводимой пробы 1 мкл.

Время удерживания диниконазола 1 мин. 55 сек.

2. Колонка стеклянная 1 м х 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 — 0,160 мм) с 5% ХЕ-60.

Температура колонки 220 °С, испарителя 240 °С, детектора 320 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 45 куб. см/мин. 10

Шкала электрометра 8 х 10 .

Объем вводимой пробы 1 мкл.

Время удерживания диниконазола 2 мин. 25 сек.

Линейный диапазон детектирования 0,1 — 2 нг.

2.6.6 Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание диниконазола в образце семян или масла (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

                           Н  х С х V
                            2

Х = ----------, Н х Р 1

где:
Н    -   высота  (площадь)  пика  диниконазола  в  стандартном
 1

растворе, мм; Н — высота (площадь) пика диниконазола в анализируемой пробе, 2 мм; V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл; Р — навеска анализируемого образца, г; С — концентрация диниконазола в стандартном растворе, мкг/мл.

Содержание остаточных количеств диниконазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор диниконазола 2 мкг/мл, разбавляют.

3. Требования техники безопасности

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории», общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации газового хроматографа и электрооборудования до 400 В.

4. Разработчики

Долженко В.И., Цибульская И.А., Блинова Т.Ф.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ВИЗР).

196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3. Телефон 470-41-98.

---