МУК 4.1.1422-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств этофумезата в корнеплодах и ботве сахарной, столовой и кормовой свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(утв. Минздравом России 24.06.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЭТОФУМЕЗАТА В КОРНЕПЛОДАХ И БОТВЕ САХАРНОЙ, СТОЛОВОЙ И КОРМОВОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.1422-03

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина) при участии Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены с 30 июня 2003 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в корнеплодах и ботве сахарной, столовой и кормовой свеклы массовой концентрации этофумезата в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.

Этофумезат — действующее вещество препарата БЕТАНЕС, КЭ (70 г/л десмедифама + 90 г/л фенмедифама + 110 г/л этофумезата), фирма-производитель «Август», Россия.

(+/-)-2-этокси-2,3-дигидро-3,3-диметилбензофуран-5-ил метансульфонат (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

C H O S 13 18 5

Мол. масса 286,3.

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления — 70 — 72 °С. Давление паров при 25 °С: 0,12 — 0,65 мПа. Растворимость в органических растворителях при 25 °С (г/куб. дм): дихлорметан, ацетон, этилацетат — более 600; толуол — 300 — 600; метанол — 120 — 150; этанол — 60 — 75; гексан — 4,7. Растворимость в воде при 25 °С — 50 мг/куб. дм.

    Этофумезат  стабилен  в  водной среде при рН 7 - 9. При кислой
среде  разлагается;  DT    (рН  5,0)  -  940  дней, с образованием

                   50

гидроксианалога.

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс > 5000 мг/кг; 50 острая дермальная токсичность (LD ) для кроликов > 2000 мг/кг; 50 острая ингаляционная токсичность (LK ) для крыс > 3970 мг/куб. м. 50

Область применения препарата:

Этофумезат рекомендуется к применению в качестве контактного селективного гербицида против однолетних двудольных и злаковых сорняков на посевах свеклы сахарной, столовой, кормовой.

Гигиенические нормативы:

ДСД — 0,1 мг/кг массы тела.

ОБУВ в воздухе рабочей зоны — 0,1 мг/куб. м.

ПДК в воде водоемов — 0,5 мг/куб. дм.

ОДК в почве — 0,2 мг/кг.

МДУ в свекле сахарной, столовой и кормовой — 0,1 мг/кг.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

(6 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы растительного материала смесью ацетон — вода, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения в хроматографируемом объеме пробы — 4 нг.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания свеклы кормовой, столовой, сахарной, в том числе десмедифама и фенмедифама.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостной хроматограф с Номер Госреестра 15945-97 ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США)

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения, с ГОСТ 7328 наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные вместимостью 50, 100 и ГОСТ 1770 1000 куб. см

Пипетки градуированные 2-го класса ГОСТ 29227 точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 куб. см

Пипетки с одной меткой 2-го класса ГОСТ 29169 точности вместимостью 20 куб. см

Пробирки градуированные вместимостью 5 ГОСТ 1770 или 10 куб. см

Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770. вместимостью 10, 25, 50, 100, 200, 500 и 1000 куб. см.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Этофумезат с содержанием действующего вещества 99,6% (ВНИИХСЗР, Россия)

Ацетон, чда ГОСТ 2603

Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная ГОСТ 6709 или перегнанная над KMnO 4

н-Гексан, хч                                       ТУ-6-09-3375
Изопропиловый спирт (пропанол-2), хч               ТУ 6-09-402-75

Кислота ортофосфорная, хч, 85% ГОСТ 6552

Метилен хлористый (дихлорметан), хч ГОСТ 12794

Метиловый спирт (метанол), хч ГОСТ 6995

Натрий сернокислый, безводный, хч ГОСТ 4166

Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233

Силикагель для колоночной хроматографии L 100 — 160 меш (фирмы «Лахема», Чехия)

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч ГОСТ 22300.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с               ТУ 64-1-2851-78
Бумажные фильтры "красная лента",                  ТУ 6-09-2678-77

обеззоленные

Воронка Бюхнера ГОСТ 25336

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Гомогенизатор

Груша резиновая

Колба Бунзена ГОСТ 25336

Колбы плоскодонные вместимостью 200 — 250 куб. см ГОСТ 9737

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью ГОСТ 9737 10, 100 и 250 куб. см

Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм

Насос водоструйный ГОСТ 10696

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М ТУ 25-11-917-74 или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария

Стаканы химические, вместимостью 400 куб. см ГОСТ 25336

Стекловата

Стеклянная колонка длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 2,1 мм, содержащая Spherisorb S5 ODS 2 зернением 5 мкм

Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS зернением 5 мкм

Шкаф сушильный ТУ 64-1-1411-76

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1005.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижных фаз для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографических колонок, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с силикагелем.

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2 Очистка этилацетата и хлористого метилена

Этилацетат (хлористый метилен) промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.3 Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2. Приготовление смеси растворителей для экстракции

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 800 куб. см и 200 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

7.3. Подготовка подвижной фазы № 1 для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 480 куб. см метанола, 50 куб. см изопропанола, добавляют 470 куб. см бидистиллированной воды и вносят 0,1 куб. см ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.4. Подготовка подвижной фазы № 2 для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 700 куб. см ацетонитрила и 300 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.5. Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3 или п. 7.4) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 0,3 куб. см/мин. или 1 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.6. Приготовление градуировочных растворов

7.6.1 Исходный раствор этофумезата для градуировки (концентрация 1 мг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,1 г этофумезата, растворяют в 50 — 70 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного стандартного раствора.

7.6.2 Раствор № 1 этофумезата для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного стандартного раствора этофумезата с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.6.1), разбавляют метанолом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот стандартный раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения этофумезата из исследуемых образцов.

7.6.3. Рабочие растворы № 2 — 5 этофумезата для градуировки (концентрация 0,2 — 2,0 мкг/куб. см)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 2, 4, 10 и 20 куб. см стандартного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.6.2), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ № 1 или № 2 (приготовленных по п. 7.3 или 7.4), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией этофумезата 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике не более 5-ти дней.

7.7. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации этофумезата в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4.1 или 9.4.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.8. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 20 — 25 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 0,5 см. Колонку промывают 25 куб. см смеси этилацетат — гексан (1:1 по объему), затем 25 куб. см гексана со скоростью 1 — 2 капли в сек. После этого колонка готова к работе.

7.9. Проверка хроматографического поведения этофумезата на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают по 0,5 куб. см стандартного раствора № 1 (п. 7.6.2). Упаривают растворитель досуха, остаток растворяют в 3-х куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.8. Промывают колонку 25 куб. см смеси гексан — этилацетата (9:1 по объему), элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан — этилацетат (7:3 по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2-х куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.2 или 7.3), анализируют на содержание этофумезата, по пп. 9.4.1 или 9.4.2.

Фракции, содержащие этофумезат, объединяют вместе и вновь анализируют по пп. 9.4.1 или 9.4.2.

Рассчитывают содержание вещества в элюатах, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения этофумезата следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы ботвы и корнеплодов свеклы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре -18 °С.

Перед анализом образцы измельчают.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция

Образец измельченных корнеплодов свеклы или ботвы массой 20 г помещают в коническую колбу (или химический стакан) вместимостью 400 куб. см, вносят 40 куб. см смеси ацетон — вода (80:20 по объему), гомогенизируют в течение 1 мин., затем добавляют 60 куб. см смеси ацетон — вода (80:20 по объему) и помещают на встряхиватель на 30 мин.

Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон — вода (80:20 по объему). Экстракт и промывку переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракт, полученный по п. 9.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (~ 20 куб. см) при температуре не выше 35 °С, внимательно следя за процессом и не допуская переброса жидкости при вспенивании. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 20 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, 50 куб. см смеси гексан — хлористый метилен (65:35 по объему), интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Водную фазу вновь переносят в делительную воронку. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см смеси гексан — хлористый метилен (65:35 по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 3-х куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.8. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 25 куб. см смеси гексан — этилацетата (9:1 по объему), элюат отбрасывают. Этофумезат элюируют с колонки 30 куб. см смеси гексан — этилацетат (7:3 по объему) со скоростью 1 — 2 капли в сек., собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют 2,5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.2 или 7.3) и анализируют на содержание этофумезата по п. 9.4.1 или 9.4.2.

9.4. Условия хроматографирования

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором Perkin-Elmer (США).

9.4.1. Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 2,1 мм, содержащая Spherisorb S5 ODS 2, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол — изопропанол — вода — ортофосфорная кислота (48:5:47:0,1 по объему)

Скорость потока элюента: 0,3 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода этофумезата: 14,7 — 15,0 мин.

9.4.2. Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Zorbax ODS, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил — вода (60:40 по объему)

Скорость потока элюента: 1,0 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода этофумезата: 4,7 — 4,9 мин.

Диапазон определяемых концентраций: 4 — 40 нг.

Образцы, дающие пики, большие чем стандартный раствор этофумезата с концентрацией 2,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.2 или 7.3).

10. Обработка результатов анализа

Содержание этофумезата в пробе рассчитывают по формуле:

                          (А х К) V

Х = ---------, m

где:
Х - содержание этофумезата в пробе, мг/кг;
А  -  концентрация  этофумезата,  найденная по градуировочному

графику, мкг/куб. см; V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см; m — масса анализируемого образца, г;

К  - коэффициент пересчета, учитывающий объем экстрактов проб,<br>

11. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н., Гарбузова А.А., Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).

141000, г. Мытищи Московской обл., ул. Семашко, д. 2, лаборатория аналитических методов контроля.