Методические рекомендации по детекции бруцелл в различном биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции
Актуально на 09.11.2026.
Как цитировать: "Методические рекомендации по детекции бруцелл в различном биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции". МУ-8-12. https://bukva.ai/docs/mu-8-12
(утв. Минздравом РФ 03.02.1997 № МУ-8-12)
3 февраля 1997 г. № МУ-8-12
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДЕТЕКЦИИ БРУЦЕЛЛ В РАЗЛИЧНОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Аннотация
Методические рекомендации предназначены для работников научно-исследовательских и практических учреждений, занимающихся вопросами идентификации микроорганизмов.
Рекомендации разработали сотрудники Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока М.Ю. Шестопалов, С.В. Балахонов, А.И. Калиновский.
Введение
Сохраняющаяся высокая заболеваемость бруцеллезом людей и животных оставляет актуальным вопрос о ранней и эффективной диагностике этого заболевания. Существующие методы либо длительны и многоэтапны (бактериологический), либо не исключают перекрестных ложноположительных результатов с представителями других таксонов бактерий, имеющих антигенное сходство с бруцеллами (комплекс иммунологических тестов).
Перспективным подходом к решению этого вопроса в лабораторной диагностике является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР), превосходящей на несколько порядков по чувствительности и специфичности традиционные иммунологические тесты и позволяющей работать с исследуемым материалом без выделения чистой культуры. Данный метод дает возможность обнаруживать единичные клетки бруцелл в различном биологическом материале: крови, сыворотке крови, молоке, моче, гистологическом материале, объектах окружающей среды в ранние — от 4 до 6 часов — сроки, высокоспецифичен и максимально адаптирован к существующей лабораторной базе.
Принцип метода
Полимеразная цепная реакция открывает возможность многократно амплифицировать (синтезировать) в пробирке участок хромосомной ДНК
бруцелл размером 269 пар, нуклеотидов, являющейся фрагментом гена оболочечного белка, с молекулярной массой 31 кД. Фрагмент, специфичный только для микроорганизмов рода Brucella, ограничен парой олигонуклеотидных праймеров, с которых термостабильная
ДНК-полимераза осуществляет синтез этого участка ДНК в присутствии 4-дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и солевого буфера, 2+ содержащего ионы магния (Mg ) и бычий сывороточный альбумин (BSA).
Синтез возможен только тогда, когда вносимая ДНК, выделенная из исследуемой пробы, окажется идентичной (комплементарной) праймерам, в противном случае амплификации не будет. Результат амплификации легко визуализируется, например, методом электрофореза в агарозном геле.
ПЦР состоит из цикла повторяющихся температурных режимов:
94 °С — 35 сек. — денатурация (расхождение) двойной цепи исследуемой ДНК до двух одиночных;
52 °С — 35 сек. — присоединение («отжиг») праймеров к идентичным участкам на одиночных цепях исследуемой ДНК;
72 °С — 35 сек. — синтез специфичного участка ДНК, Tag-полимеразой, путем удлинения праймеров.
За каждый такой цикл происходит удвоение числа копий этого n
участка ДНК, что можно выразить как 2 , где n - количество циклов амплификации. Таким образом, за 40 - 50 циклов амплифицируется
фрагмент ДНК, в достаточном количестве для обнаружения его методом гель-электрофореза.
В целом же вся процедура ПЦР-диагностики состоит из 3 этапов:
Лабораторное оборудование
1. Микроцентрифуга на 12000 — 14000 об./мин.
2. Автоматические микропипетки на 20, 200 и 1000 мкл
3. Одноразовые наконечники к пипеткам на 200 мкл
4. Наконечники к пипеткам на 1000 мкл
5. Пластиковые микропробирки объемом 500 мкл
6. Пластиковые микропробирки объемом 1500 мкл
7. ДНК-амплификатор с программным обеспечением (МС-2) или аналогичный
9. Фотоаппарат с красным или оранжевым светофильтром
10. Негативная фотопленка (типа ФН-64, «Микрат-300»)
11. Аппарат для горизонтального гель-электрофореза
12. Источник напряжения постоянного тока.
Химические реактивы
NaOH (категории х.ч. или ч.д.а.) NaCl (х.ч.) 96% этанол Трис-ОН (Трис-основной, м.в. 121.1) ЭДТА x Na («Трилон-Б») 2
H BO (Борная кислота)
3 3
Агароза (желательно использовать агарозу с низким
электроэндоосмосом и высокой плотностью геля, например, фирмы
SIGMA type 1 или 2) Бромистый этидий Мертиолят натрия HCl концентрированная Бромфеноловый синий Глицерин.
Растворы для выделения ДНК из проб
10 М NaOH (хранить в полиэтиленовом флаконе)
ТЕ-буфер: 10 мМ Трис-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА (стерилизовать автоклавированием).
Компоненты для проведения ПЦР и гель-электрофореза
1. <a id="p100043"></a>Солевой ПЦР-буфер для проведения амплификации 10х:
100 мМ Трис-HCl, pH 8,5 при 37 °С
100 мМ MgCl
2
1000 мМ KCl
2. <a id="p100044"></a>2,5 мМ раствор dNTP
3. <a id="p100045"></a>Водный раствор BSA 2 мг/мл
4. <a id="p100046"></a>Дистиллированная или бидистиллированная вода
5. <a id="p100047"></a>Олигонуклеотидные праймеры:
Bru 1 5'-GCA GTC AGA CGT TGC CTA TT-3'
Bru 2 5'-GTC TGA GGT GTT CAG CCT Т-3'.
Приготовление лизирующего раствора и выделение ДНК из проб
Приготовление растворов, выделение ДНК, ПЦР и гель-электрофорез осуществляют в раздельных помещениях для предотвращения контаминации компонентов, проб и оборудования.
Для выделения ДНК из одной пробы объемом 10 мкл приготавливают щелочной, лизирующе-осаждающий раствор следующего состава:
2. 22 мкл дистиллированной воды
Общий объем этой смеси составляет 182 мкл. Данный раствор можно приготовить в отдельных пробирках объемом 1,5 мл (последовательно добавляя все четыре указанных компонента) перед внесением в них проб, либо в отдельном полиэтиленовом или пластиковом флаконе с расчетом на все число проб плюс одна (учитывая погрешности микропипеток). Щелочной раствор приготавливают перед выделением ДНК из проб и впрок не заготавливают.
Исследуемую пробу объемом 10 мкл добавляют в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл, содержащую 182 мкл щелочного, лизирующе-осаждающего раствора и сразу же перемешивают путем легкого встряхивания. Пробирку выдерживают при комнатной температуре 10 — 15 мин. Пробу центрифугируют 5 мин. при 12000 — 14000 об./мин., супернатант сливают, остаткам раствора в пробирке дают стечь на фильтровальную бумагу.
К осадку на дне пробирки (который может быть малозаметен) добавляют 500 мкл 80% этанола, пробирку несколько раз осторожно переворачивают и центрифугируют 2 минуты при 12000 — 14000 об./мин. Этанол сливают, а пробирку подсушивают на фильтровальной бумаге в течение 5 — 10 мин. К осадку добавляют 30 мкл ТЕ-буфера или дистиллированной воды и содержимое пробирки перемешивают путем пипетирования в отдельном стерильном наконечнике.
Примечания. 1. ДНК можно выделять из проб менее и более 10 мкл — тогда соответственно необходимо сделать количественный пересчет компонентов щелочного, лизирующе-осаждающего раствора.
2. Выделенные препараты ДНК можно хранить в условиях холодильника в течение 1 месяца.
Проведение ПЦР
ПЦР проводят только в одноразовых микропробирках с использованием одноразовых наконечников для внесения всех компонентов амплификационной смеси.
Подготавливают и пронумеровывают пробирки на 500 мкл по числу исследуемых проб, плюс три пробирки: для положительного и отрицательного контролей и разведенной в 10 раз дистиллированной водой Tag-ДНК-полимеразы.
На одну пробу готовят амплификационную смесь объемом 25 мкл следующего состава:
Исследуемую пробу всегда вносят в последнюю очередь, после чего всю смесь перемешивают пипетированием и закрывают 85 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл). В качестве положительного контроля используют ДНК B. melitensis Rev-1 или B. abortus 19-BA, выделенные описанным щелочным методом, в отрицательном контроле используется дистиллированная вода вместо анализируемой пробы.
Пробирки закрывают и помещают в амплификатор со следующей температурно-временной программой одного цикла:
Количество циклов 50. За это время в каждом цикле происходит удвоение числа копий ограниченного праймерами участка хромосомной ДНК, причем, каждая вновь синтезируемая цепь становится матрицей для присоединения праймеров и снова амплифицируется, что позволяет за 50 циклов синтезировать фрагмент ДНК в количестве достаточном для обнаружения его с помощью электрофореза в агарозном геле.
Примечания. 1. Солевой ПЦР-буфер, раствор dNTP, раствор BSA, праймеры, Tag-ДНК-полимераза обязательно хранят в морозильнике и размораживают (кроме Tag-ДНК-полимеразы) перед приготовлением амплификационной смеси.
2. Амплификационную смесь, состоящую из ПЦР-буфера, dNTP, BSA и воды можно приготовить заранее в достаточных количествах и заморозить небольшими аликвотами.
Гель-электрофорез продукта ПЦР
После завершения программы амплификации, пробы смешивают с 2,5 мкл раствора для нанесения проб и помещают в лунки горизонтального 1,5% агарозного геля, содержащего 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Электрофорез проводят в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряжении 30 В/см в течение 25 мин., не допуская выхода красителя бромфенолового синего из геля.
Гель просматривают в Уф-свете и результат фоторегистрируют. Амплифицированные фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая флюоресцирующие при 254 — 302 нм в геле полосы анализируемых проб, с полосой положительного контроля. Положительными могут считаться только те пробы, амплифицированные фрагменты которых (флюоресцирующие полоски в геле) находятся строго на уровне фрагмента положительного контроля.
Данный метод детекции бруцелл, с используемыми праймерами и представленными температурно-временными параметрами, позволяет обнаруживать единичные клетки в пробе за 50 циклов амплификации у всех представителей рода Brucella, что выражается флюоресцирующей полосой в геле агарозы, размером 269 пар нуклеотидов.
Примечание. Бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все работы, связанные с перемещением агарозного геля, проводите в перчатках.