МУ 3.5.1.4130-25. 3.5.1. Дезинфекция. Оценка эффективности дезинфицирующих средств в отношении микроорганизмов в составе микробных ассоциаций (биологических пленок). Методические указания
Актуально на 03.11.2026.
Как цитировать: "МУ 3.5.1.4130-25. 3.5.1. Дезинфекция. Оценка эффективности дезинфицирующих средств в отношении микроорганизмов в составе микробных ассоциаций (биологических пленок). Методические указания". МУ 3.5.1.4130-25. https://bukva.ai/docs/mu-3-5-1-4130-25
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 11.04.2025)
Примечание
Начало действия документа - 11.09.2025.
ГОСУДАРСТВЕННОЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 11 апреля 2025 г.
Дата введения 11 сентября 2025 г.
3.5.1 ДЕЗИНФЕКЦИЯ
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ В ОТНОШЕНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В СОСТАВЕ МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ (БИОЛОГИЧЕСКИХ ПЛЕНОК)
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.5.1.4130-25
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.П. Игонина); ФБУН НИИ СБМ Роспотребнадзора (Л.С. Федорова, А.С. Ивкина, Е.Н. Ильина); Институтом дезинфектологии ФБУН «ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (Ю.В. Демина, Н.И. Еремеева, А.В. Ильякова); ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (В.Г. Акимкин, А.В. Тутельян).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 11 апреля 2025 г.
I. Область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУ) описывают методы оценки эффективности дезинфицирующих средств (далее — ДС) и их активных действующих веществ в отношении микроорганизмов в составе микробных ассоциаций (биологических пленок, далее — БП), с целью разработки режимов применения ДС в практических условиях для профилактики инфекционных заболеваний, в том числе, связанных с оказанием медицинской помощи (далее — ИСМП) <1>.
<1> Федеральный закон от 03.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»; Федеральный закон от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации».
1.2. МУ предназначены для специалистов, осуществляющих федеральный государственный санитарно-эпидемиологический контроль (надзор), а также могут быть использованы специалистами испытательных лабораторий, аккредитованных в установленном порядке <2>, осуществляющих исследования и испытания ДС и их субстанций в процессе разработки, производства, применения, при проведении испытаний, исследований и экспертиз с целью государственной регистрации и сертификации, органов исполнительной власти субъектов Российской Федерации в сфере охраны здоровья, медицинских, научно-исследовательских и образовательных организаций.
<2> Федеральный закон от 28.12.2013 № 412-ФЗ «Об аккредитации в национальной системе аккредитации».
II. Общие положения
2.1. Микроорганизмы на абиотических поверхностях (например, поверхностях в помещениях, оборудовании, мебели, медицинских изделиях, включая эндоскопы) могут находиться в свободной планктонной форме и в форме микробных ассоциаций — БП. В целях неспецифической профилактики инфекционных болезней для дезинфекции объектов рекомендуется использовать ДС, активные в отношении обеих форм, в том числе в отношении микроорганизмов в составе БП <3>.
<3> СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).
БП представляют собой микробные сообщества, прикрепленные к поверхности, находящиеся в их собственном внеклеточном экзополимерном матриксе, состоящем из нескольких типов биополимеров, вклющем внеклеточные полисахариды, белки, липиды и ДНК [13].
2.2. Нахождение микроорганизмов в составе БП способствует их устойчивости к ДС, которая обусловлена: затруднением или неспособностью действующих веществ ДС проникать внутрь матрикса; связыванием и инактивацией их полимерами матрикса; замедленной скоростью деления бактерий в БП; наличием в БП метаболически неактивных бактериальных клеток, малочувствительных к ДС [7, 8, 10, 15].
2.3. Исследования эффективности ДС с целью разработки режимов дезинфекции объектов внешней среды проводят в соответствии с методическими документами <4>, на основании которых оценку эффективности и разработку режима применения ДС рекомендуется проводить с использованием микроорганизмов в свободной планктонной форме. Так как в составе БП микроорганизмы более устойчивы к воздействию ДС, чем в планктонной форме, для достижения эффективности обеззараживания объектов, загрязненных БП, целесообразно разрабатывать и применять ДС в режимах, эффективных в отношении микроорганизмов в БП.
<4> Глава III Р 4.2.3676-20 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности», утвержденного руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.12.2020, с изменениями, внесенными Р 4.2.4020-24 «Изменения № 1 в Р 4.2.3676-20 „Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности“, утвержденным руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 31.05.2024 (далее — Р 4.2.3676-20).»
2.4 На объектах БП могут существовать во влажном и в сухом виде.
Влажные биопленки образуются в местах, где имеется постоянный приток питательных веществ в среду, например, в медицинских мочевых катетерах, дренажных трубках, трубках для подачи кислорода [17]. С потоком жидкости БП эффективнее развиваются и быстрее распространяются в среде. БП, растущие на поверхностях при непрерывном потоке среды, называют динамическими [11, 14], и для их создания в лабораторных условиях используются динамические методы культивирования.
Сухие БП встречаются на поверхностях помещений, оборудования, приборов, и для их моделирования используют статические методы культивирования [9, 16].
2.5. Исследования эффективности ДС в отношении микроорганизмов в составе БП проводят с соблюдением требований биологической безопасности при работе с тест-микроорганизмами» <5> и при работе с химическими ДС <6>.
<5> Глава IV СанПиН 3.3686-21.
<6> Пункт 3.1.5 Р 4.2.3676-20.
III. Методы исследований эффективности дезинфицирующих средств в отношении микроорганизмов в составе биологических пленок на абиотических объектах
3.1. Исследования эффективности ДС в отношении микроорганизмов в составе БП проводят, в зависимости от задач, при культивировании БП на различных объектах (например, полистироловых планшетах с разным количеством лунок (6, 12, 24 или 96), тест-поверхностях из различных материалов [12]) в 2 этапа:
- 1 этап — определение спектра антимикробной активности и отбор ДС, эффективных в отношении микроорганизмов в составе БП, с использованием метода статического культивирования БП на планшетах;
- 2 этап — изучение дезинфицирующей активности и разработка режимов дезинфекции. Проводится при получении положительного результата на этапе 1. Исследование выполняют с использованием статического метода культивирования БП для разработки режимов дезинфекции поверхностей в помещениях и медицинских изделий, и динамического метода — для разработки режимов дезинфекции медицинских изделий, постоянно контактирующих с биологическими жидкостями.
3.1.1. Статический метод культивирования БП на планшетах является стандартной модельной системой для изучения микробных сообществ in vitro. Данный метод является достаточно простым и имеет высокую пропускную способность.
3.1.2. Динамический метод основан на принципе культивирования БП в процессе постоянного движения питательной среды и микроорганизма, при котором создаются условия для роста БП, более похожие на естественные [17].
3.2. Для количественной оценки биопленкообразования используют метод измерения оптической плотности, который основан на сорбции молекул красителя на структурах БП, с последующей их отмывкой (десорбцией) в органических растворителях [12, 16].
3.3. Для определения количества жизнеспособных клеток зрелую БП суспендируют и гомогенизируют в жидкой среде с помощью соскабливания, вихревой обработки или обработки ультразвуком с последующим асептическим удалением аликвот суспендированной БП и посевом из последовательных разведений на питательный агар.
3.4. При испытаниях ДС и их субстанций в отношении микроорганизмов в составе БП в качестве тест-микроорганизмов используют штаммы Pseudomonas aeruginosa АТСС 15442 и Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р — для оценки эффективности в отношении бактерий в составе БП, и Candida albicans АТСС 10231 — для оценки эффективности в отношении грибов в составе БП <7>.
<7> Примечание: возможно использование других штаммов тест-микроорганизмов, соответствующих указанным по устойчивости к эталонным ДС и с установленной способностью к биопленкообразованию.
3.5. Для нейтрализации действующих веществ ДС по завершении экспозиции используют химические вещества, нейтрализующие его действие: нейтрализующий бульон по Ди-Ингли, нейтрализатор универсальный, гипосульфит натрия 1% <8>.
<8> Пункт 3.1.6 Р 4.2.3676-20.
3.6. Перед работой с ДС проводят химико-аналитические исследования по подтверждению соответствия его состава рецептуре. Далее рабочие растворы ДС готовят на стерильной водопроводной воде комнатной температуры в вытяжном шкафу или в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией, с защитой органов дыхания респираторами, кожи рук — резиновыми перчатками, глаз — защитными очками.
IV. Исследование активности дезинфицирующих средств и их субстанций в отношении микроорганизмов в составе биологических пленок in vitro
4.1. Данный метод рекомендован для исследования и оценки антимикробной активности и спектра антимикробного действия ДС в отношении микроорганизмов в составе БП на этапе первичного отбора с целью определения дальнейших перспектив его изучения для борьбы с микробными БП.
4.2. Для формирования БП бактерий используют рабочую культуру микроорганизма, культивированную на твердой питательной среде (ГРМ-агар, триптон-соевый агар (англ. Trypticase Soy Agar, далее — ТСА), мясо-пептонный агар (далее — МПА) в течение 18 — 24 ч при температуре плюс (37 \pm 1) °C; для грибов — рабочую культуру микроорганизма, культивированную на агаре Сабуро в течение 48 ч при температуре плюс (27 \pm 1) °C.
4.3. Для приготовления суспензии тест-микроорганизма культуру смывают с агара стерильным физиологическим раствором. Полученную взвесь разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации ~ 1 x 109 клеток в 1 см3, соответствующей по мутности 3,3 — 3,5 единицам по стандарту Мак-Фарланда (для грибов рода Candida — 4,4 — 4,6 единицам по стандарту Мак-Фарланда), определяемым с помощью денситометра. Далее приготовленную микробную взвесь разводят стерильным питательным бульоном (для бактерий — ГРМ-бульон, триптон-соевый бульон (далее — ТСБ), мясо-пептонный бульон (далее — МПБ), лизогенный бульон (англ. lysogeny broth, далее — LB-бульон), для грибов — бульон Сабуро) до концентрации ~ 1 x 106 клеток в 1 см3.
4.4. В лунки стерильного 96-ти луночного плоскодонного полистиролового планшета вносят по 200 мкл микробной взвеси в концентрации ~ 1 x 106 клеток в 1 см3 с использованием стерильных наконечников и дозатора. Один штамм на одну концентрацию рекомендуется использовать в 8 повторах (использовать 8 лунок), что дает возможность получить статистически достоверные данные. В качестве отрицательного контроля используют лунки с 200 мкл питательного бульона (ГРМ-бульон, ТСБ, МПБ, LB-бульон, бульон Сабуро) без добавления бактериальной суспензии. Затем планшеты закрывают и инкубируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 24 ч — для формирования БП бактерий, при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 48 ч — для формирования БП грибов.
4.5. После окончания инкубации удаляют планктонную культуру из лунок вручную с использованием дозаторов или с помощью автоматических планшетных промывателей, затем трехкратно промывают, используя 200 мкл стерильной дистиллированной воды на одну лунку. После последнего цикла промывки воду полностью удаляют и высушивают планшет в течение 45 — 60 мин.
4.6. Затем в опытную часть лунок вносят по 200 мкл рабочего раствора ДС или действующего вещества в различных концентрациях, приготовленных на стерильной водопроводной воде. В контрольных лунках вместо растворов испытываемых средств используют стерильную водопроводную воду. Через заданное время экспозиции из лунок удаляют раствор ДС с помощью дозаторов, затем добавляют по 200 мкл нейтрализатора, который через 10 мин удаляют.
4.7. Биомассу БП оценивают по уровню экстракции 96% этанолом или 30% уксусной кислоты красителя, который измеряют на микропланшетном ридере при длине волны 580 — 600 нм в единицах оптической плотности (ед, ОП 580 — 600). Для этого в лунки вносят по 200 мкл 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового и выдерживают 30 мин при комнатной температуре, после чего удаляют краситель из лунок. Краситель, не связавшийся с БП, удаляют трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой с помощью многоканального дозатора. Затем планшеты высушивают на фильтровальной бумаге, после чего в лунки добавляют по 200 мкл 96% этанола или 30% уксусной кислоты и выдерживают 20 мин при комнатной температуре, далее проводят измерение оптической плотности элюатов с помощью спектрофотометра при длине волны 580 — 600 нм.
4.8. Жизнеспособность клеток оценивают качественным и (или) количественным методом: по наличию или отсутствию роста в жидкой питательной среде, или по числу колониеобразующих единиц (далее — КОЕ) после высева из последовательных децимальных разведений на твердые питательные среды.
Для качественного определения в лунки 96-ти луночного плоскодонного полистиролового планшета вносят 200 мкл питательного бульона (ГРМ-бульон, ТСБ, МПБ, LB-бульон, бульон Сабуро), закрывают крышкой. Посевы помещают в термостат и культивируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток для роста грибов.
Для количественного определения в лунки 96-ти луночного плоскодонного полистиролового планшета вносят по 200 мкл стерильного физиологического раствора и обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц, поместив планшет в ультразвуковую ванну. Затем физиологический раствор засевают по 0,1 см3 на плотную питательную среду (для бактерий — ГРМ-агар, ТСА, МПА; для грибов — агар Сабуро) и растирают стерильным шпателем. Для подсчета КОЕ/см3 делают десятикратные разведения. Посевы помещают в термостат и культивируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста бактерий или при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток для роста грибов.
4.9. ДС считают эффективным в отношении тест-микроорганизмов в БП и перспективным для дальнейшего исследования с целью разработки режимов применения при отсутствии роста микроорганизмов в лунках (при качественном методе) или при снижении количества жизнеспособных клеток в составе БП после воздействия ДВ не менее, чем на 4 порядка, и снижении показателя оптической плотности не менее, чем на 70% по сравнению с контролем.
V. Исследование эффективности дезинфицирующих средств в отношении микроорганизмов в биологической пленке, сформированной на тест-поверхностях
5.1. Данный метод рекомендуется для оценки эффективности ДС в отношении микроорганизмов в составе БП при дезинфекции, например, поверхностей в помещениях, мебели, оборудования, приборов, медицинских изделий.
5.2. В качестве тест-поверхностей используют: предварительно простерилизованные поверхности размером 5 x 5 см (например, из плитки, линолеума, кафеля, пластика), предназначенные для разработки режима дезинфекции поверхностей в помещениях и (или) предварительно простерилизованные поверхности размером 1 x 1 см из металла, стекла, пластмасс и резин, предназначенные для разработки режимов дезинфекции изделий медицинского назначения.
5.3. Стерильные тест-поверхности размером 5 x 5 см помещают по одной на дно стерильной чашки Петри и располагают на рабочем столе бокса микробиологической безопасности II класса. Затем пипеткой на тест-поверхности наносят по 10 см3 микробной взвеси в концентрации 1 x 106 клеток в 1 см3, приготовленной в соответствии с п. 4.3. Поверхности размером 1 x 1 см помещают в чашку Петри одним слоем и заливают суспензией микроорганизмов так, чтобы они были полностью покрыты.
Контаминированные тест-поверхности инкубируют в термостате при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 24 ч для роста бактерий или при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста грибов.
5.4. Затем тест-поверхности, покрытые БП, извлекают из чашки Петри и трижды промывают стерильной дистиллированной водой с целью удаления планктонных клеток. После промывки тест-поверхности помещают на дно стерильной чашки Петри и подсушивают, приоткрыв чашку Петри (до полного высыхания) при температуре плюс 18 — 22 °C и относительной влажности 40 — 60%, после чего обрабатывают раствором ДС.
5.5. Обработку тест-поверхностей размером 5 x 5 см раствором ДС проводят способом протирания или орошения. При обработке способом протирания перед нанесением раствора ДС на тест-поверхности помещают стерильную марлевую салфетку размером 5 x 5 см для предотвращения стекания раствора ДС, затем наносят раствор ДС с помощью пипетки, протирают тест-объект этой салфеткой и выдерживают время экспозиции. При обработке способом орошения раствор ДС наносят с помощью распылителя с дозатором. Количество наносимого раствора ДС зависит от рекомендуемой нормы расхода, указанной в инструкции по применению средства: например, если норма расхода составляет 100 см3 на 1 м2, то на объект размером 5 x 5 см наносят 0,25 см3 средства.
Тест-поверхности размером 1 x 1 см обрабатывают способом погружения в раствор ДС.
5.6. Контрольные тест-поверхности обрабатывают так же, как и опытные, используя вместо раствора ДС стерильную водопроводную воду.
5.7. После окончания экспозиции чашки с тест-поверхностями заливают 10 см3 раствора нейтрализатора, через 10 мин тест-поверхности извлекают и промывают стерильной дистиллированной водой, затем переносят в стерильные чашки Петри.
5.8. Эффективность воздействия ДС при обеззараживании поверхностей 5 x 5 см определяют количественным методом, для чего в чашки Петри с тест-поверхностями вносят по 10 см3 стерильного физиологического раствора и обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц в ультразвуковой ванне. Затем физиологический раствор засевают по 0,1 см3 на плотную питательную среду (для бактерий — ГРМ-агар, ТСА, МПА; для грибов — агар Сабуро). Для подсчета КОЕ/см3 делают десятикратные разведения.
5.9. Тест-объект размером 1 x 1 см после дезинфекции извлекают стерильным пинцетом из раствора ДС и последовательно переносят в пробирку с 5 см3 стерильного раствора нейтрализатора и дистиллированной воды на 10 мин в каждую. Для качественного определения жизнеспособности микроорганизмов тест-поверхности переносят в пробирки с 10 см3 питательного бульона (ГРМ-бульон, ТСБ, МПБ, LB-бульон, бульон Сабуро), обеспечивая полное погружение в среду, и инкубируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток для роста грибов. Для количественного учета результатов тест-поверхности погружают в пробирки, содержащие 5 см3 стерильного физиологического раствора, ставят в ультразвуковую ванну и обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц. По завершении обработки физиологический раствор засевают по 0,1 см3 на плотную питательную среду (для бактерий — ГРМ-агар, ТСА, МПА; для грибов — агар Сабуро).
Посевы помещают в термостат и культивируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток для роста грибов.
5.10. Учет результатов обеззараживания тест-поверхностей размером 5 x 5 см проводят количественным методом; тест-поверхностей размером 1 x 1 см — качественным и количественным методом.
При качественном методе оценки контролируют наличие или отсутствие роста в жидкой питательной среде. При количественном методе оценки определяют остаточную обсемененность тест-поверхностей после обработки раствором ДС в выбранном режиме. Подсчитывают количество выросших колоний и рассчитывают процент обеззараживания, принимая количество колоний, снятых с контрольных поверхностей, за 100%. Для получения достоверных результатов исследования проводят в трех повторах. Данные обрабатывают с использованием пакета статистических компьютерных программ. При значении p < 0,05 результат считают статистически значимым.
5.11. Критерий эффективности ДС при обеззараживании тест-поверхностей, имитирующих поверхности в помещениях, контаминированных тест-микроорганизмом в составе биологической пленки, — не менее 99,99%; критерий эффективности ДС при обеззараживании тест-поверхностей, имитирующих изделия медицинского назначения, — не менее 100,0%.
VI. Исследование эффективности ДС с использованием динамического метода культивирования биологических пленок
6.1. С использованием динамического метода культивирования БП разрабатывают режимы дезинфекции изделий медицинского назначения, медицинских инструментов, в том числе эндоскопов, подверженных постоянному контакту с биологическими жидкостями. В качестве тест-объектов используют поверхности из металлов, стекла, резин, пластмасс размером 1 x 1 см.
6.2. Для динамического культивирования БП применяют систему, включающую бокс (герметичный резервуар с крышкой, по сторонам имеющий вход и выход для прикрепления трубок, по которым с помощью перистальтического насоса в него поступает питательная среда с культурой микроорганизма; внутри бокса находятся тест-поверхности, на которых формируется БП); а также емкость с питательным бульоном и перистальтический насос (прибор, обеспечивающий пульсирующее движение жидкости в системе), соединенные между собой силиконовыми трубками длиной 40 — 50 см и диаметром 4 — 8 мм. Все съемные элементы системы (трубки, бокс, тест-поверхности, колба с питательной средой) должны быть предварительно простерилизованы.
Культивирование осуществляется в замкнутой системе, где питательные вещества и продукты жизнедеятельности микроорганизмов непрерывно циркулируют в среде (рис. 1).
Рис. 1. Схема динамического культивирования БП
6.3. БП на поверхностях при динамическом методе культивирования создают в два этапа.
6.3.1. На первом этапе для адгезии микробных клеток стерильные тест-поверхности помещают в чашки Петри, заливают микробной суспензией, приготовленной в соответствии с п. 4.3, и инкубируют в термостате в течение 4 — 5 ч при температуре плюс (37 \pm 1) °C — для бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C — для грибов.
6.3.2. Второй этап — окончательное формирование БП. Для этого тестируемую поверхность после инкубации размещают в подготовленном боксе. Два свободных конца трубок опускают в колбу с питательной средой объемом 200 см3. С целью фиксации трубок при работе перистальтического насоса на него устанавливают кассету (держатель) и закрепляют в ней одну из трубок ограничительными зажимами (стопперами), установленными по обе стороны от кассеты (рис. 1). Всю систему (бокс с тест-объектами, подключенные трубки, насос и емкость с питательной средой) помещают в термостат и запускают насос, выставив скорость потока от 4 до 6 об/мин. Длительность инкубации при температуре плюс (37 \pm 1) °C составляет 24 ч для бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C — 48 ч для грибов при непрерывно работающем насосе.
6.4. После завершения инкубационного периода останавливают работу насоса и извлекают трубки из колбы с питательной средой, сливая из них остатки питательной среды с культурой микроорганизма. Затем из бокса извлекают тест-поверхность и трижды отмывают ее стерильной дистиллированной водой от планктонных клеток. Подготовленный тест-объект погружают в пробирку с раствором изучаемого ДС, объемом 5 см3 и выдерживают выбранное время экспозиции. Контрольные тест-объекты погружают в пробирки со стерильной водопроводной водой такого же объема.
6.5. После дезинфекции тест-объект извлекают стерильным пинцетом из раствора ДС и последовательно переносят в пробирки с 5 см3 стерильного раствора нейтрализатора, а затем стерильной дистиллированной воды — на 10 мин в каждую. Жизнеспособность клеток оценивают качественным (или) количественным методом: по наличию или отсутствию роста в жидкой питательной среде или по числу КОЕ после высева из последовательных децимальных разведений на твердые питательные среды. Для качественного определения жизнеспособности микроорганизмов тест-поверхности переносят в пробирки с 5 см3 питательного бульона (ГРМ-бульон, ТСБ, МПБ, LB-бульон, бульон Сабуро), обеспечивая полное погружение в среду, и инкубируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток для роста грибов. Для количественного учета тест-поверхности погружают в пробирки, содержащие 5 см3 стерильного физиологического раствора, и ставят в ультразвуковую ванну, где обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц. По завершении обработки физиологический раствор засевают по 0,1 см3 на плотную питательную среду (для бактерий — ГРМ-агар, ТСА, МПА; для грибов — агар Сабуро). Посевы помещают в термостат и культивируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток для роста грибов.
6.6. Учет результатов при качественном методе оценки проводят путем контроля наличия или отсутствия роста в жидкой питательной среде. При количественном методе оценки определяют остаточную обсемененность тест-поверхностей после обработки раствором ДС в выбранном режиме. Подсчитывают количество выросших колоний и рассчитывают процент обеззараживания, принимая количество колоний, снятых с контрольных поверхностей, за 100%. Для получения достоверных результатов исследования проводят в трех повторах. Данные обрабатывают с использованием пакета статистических компьютерных программ. При значении p < 0,05 результат считают статистически значимым.
6.7. Критерий эффективности ДС при обеззараживании тест-объектов, имитирующих изделия медицинского назначения, — не менее 100,0%.
Исследование эффективности ДС в отношении микроорганизмов в БП на трубках (резиновых, пластиковых)
6.8. Данную методику используют при необходимости разработки режимов дезинфекции медицинских изделий, имеющих каналы (например, эндоскопы).
6.9. Рабочую суспензию микроорганизмов готовят в соответствии с п. 4.3 и вносят в стерильную пробирку в количестве 10 — 15 мл.
6.10. Стерильные пластиковые или резиновые трубки размером 40 — 50 см опускают одним концом в пробирку с микробной суспензией, а другим — в чистый питательный ГРМ-бульон (для грибов — бульон Сабуро) объемом 200 см3 (рис. 2 (а)).
Пробирку с микробной суспензией устанавливают в штативе, и всю систему вместе с трубкой и питательной средой размещают в термостате. Затем устанавливают в термостате насос и прикрепляют к нему кассету (держатель) для трубок. На панели насоса выставляют скорость потока от 4 до 6 об/мин для закачивания суспензии из пробирки в трубку. Необходимо закачать суспензию из пробирки в трубку до момента соприкосновения с питательным бульоном. После заполнения трубки останавливают насос и оставляют всю систему в термостате на 4 — 5 ч при температуре плюс (37 \pm 1) °C для бактерий и плюс (27 \pm 1) °C — для грибов с целью инициации первичной адгезии микроорганизмов.
6.11. Спустя инкубационное время конец трубки, опущенной в пробирку, вынимают и переносят в питательный бульон для замыкания цикла (рис. 2 (б)). На панели насоса выставляют скорость потока от 4 до 6 об/мин и включают его.
Инкубацию проводят при непрерывно работающем насосе при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 24 ч — для бактерий и плюс (27 \pm 1) °C в течение 48 ч — для грибов.
Рис. 2. Культивирование БП в динамических условиях в трубках: (а) — схема подготовки к стадии инициации адгезии клеток микроорганизмов на внутренней поверхности трубки; (б) — схема проведения динамического культивирования БП в замкнутой системе
6.12. По завершении инкубации останавливают работу насоса, затем снимают с трубки зажимы и кассету для трубок. Трубку с выращенной БП переносят в Бокс микробиологической безопасности II класса. Стерильными ножницами трубку нарезают на равные части по 5 см. Нарезанные трубки (тест-объекты) промывают дистиллированной водой 2 — 3 раза. Вносят нарезанные трубки в стерильные чашки Петри и оставляют сушиться на 40 — 60 мин с приоткрытой крышкой при включенном ламинарном потоке.
Далее в чашки добавляют 15 — 20 см3 раствора изучаемого ДС так, чтобы на протяжении всего времени экспозиции трубки были полностью погружены в раствор, избегая образования в них пузырьков воздуха. В качестве контроля трубку с выращенной БП погружают в чашку Петри со стерильной водопроводной водой.
После экспозиции обработанные трубки аккуратно вынимают из раствора ДС, встряхивают с помощью пинцета для слива лишнего ДС и переносят последовательно в чашки Петри, содержащие 15 — 20 см3 стерильного раствора нейтрализатора, выдерживают в течение 10 мин, а затем переносят в чашку со стерильной водопроводной водой на такой же срок.
6.13. Жизнеспособность клеток оценивают качественным и (или) количественным методом. Для качественного определения тест-объекты переносят в пробирки с 10 см3 питательного бульона (ГРМ-бульон, ТСБ, МПБ, LB-бульон, бульон Сабуро), обеспечивая полное погружение в среду с заполнением каналов без образования пузырьков воздуха, и инкубируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч для роста бактерий и при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток для роста грибов. Для количественного определения тест-объекты погружают в пробирки, содержащие 10 см3 стерильного физиологического раствора, и ставят в ультразвуковую ванну, где обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц. По завершении обработки физиологический раствор засевают по 0,1 см3 на плотную питательную среду (для бактерий — ГРМ-агар, ТСА, МПА; для грибов — агар Сабуро). Для подсчета КОЕ/см3 в контрольной пробирке делают десятикратные разведения. Посевы помещают в термостат и культивируют при температуре плюс (37 \pm 1) °C в течение 48 ч — для бактерий или при температуре плюс (27 \pm 1) °C в течение 2 — 10 суток — для грибов.
6.14. Учет результатов проводят путем контроля наличия или отсутствия роста в жидкой питательной среде или оценки остаточной обсемененности тест-объектов после обработки раствором ДС в выбранном режиме. После подсчета выросших колоний рассчитывают процент обеззараживания, принимая количество колоний, снятых с контрольных объектов, за 100%. Для получения достоверного результата исследования проводят в трех повторах и рассчитывают среднее число КОЕ на тест-объекте. Данные обрабатывают с использованием пакета статистических компьютерных программ. При значении p < 0,05 результат считают статистически значимым.
6.15. Критерий эффективности ДС при обеззараживании тест-объектов, имитирующих изделия медицинского назначения, — не менее 100,0%.
ОБОРУДОВАНИЕ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ
1. При проведении исследования эффективности ДС в отношении БП применяют средства измерений, испытательное и вспомогательное оборудование, реактивы, питательные среды, расходные и вспомогательные материалы, приведенные в таблицах 1 - 5.
Расходные и вспомогательные материалы
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Федеральный закон от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации».
3. Федеральный закон от 28.12.2013 № 412-ФЗ «Об аккредитации в национальной системе аккредитации».
4. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
5. МР 4.2.0161-19 «Методы идентификации биологических пленок микроорганизмов на абиотических объектах».
6. Р 4.2.3676-20 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности».
7. Алешукина А.В., Голошва Е.В., Твердохлебова Т.И. Исследование влияния дезинфицирующих средств на биопленкообразующие неферментирующие бактерии//Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. — 2020. — № 1 (205). — С. 89 — 94.
8. Глушанова Н.А., Блинов А.И., Алексеева Н.Б. Бактериальные биопленки в инфекционной патологии человека//Медицина в Кузбассе. — 2015. — N. Спецвыпуск 2. — С. 30 — 35.
9. Лямин А.В., Боткин Е.А., Жестков А.В. Методы выявления биопленок в медицине: возможности и перспективы//Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2012. — Т. 14. — № 1. — С. 17 — 22.
10. Тутельян А.В., Романова Ю.М., Маневич Б.В., Юшина Ю.К., Федорова Л.С., Синицина О.А., Синицин А.П., Емшанов О.В. Методы борьбы с биологическими пленками на пищевых производствах//Молочная промышленность. — 2020. — № 11. — С. 48 — 53.
11. Barros J., Monteiro F.J., Ferraz M.P. Bioengineering approaches to fight against orthopedic biomaterials related-infections//International journal of molecular sciences. — 2022. — Т. 23. — № 19. — С. 11658.
12. Coenye T. et al. Should standardized susceptibility testing for microbial biofilms be introduced in clinical practice?//Clinical Microbiology and Infection. — 2018. — Т. 24. — № 6. — С. 570 — 572.
13. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections//science. — 1999. — Т. 284. — № 5418. — С. 1318 — 1322.
14. Li P. et al. Bacterial biofilm formation on biomaterials and approaches to its treatment and prevention//International Journal of Molecular Sciences. — 2023. — Т. 24. — № 14. — С. 11680.
15. Li Q. et al. Formation of multispecies biofilms and their resistance to disinfectants in food processing environments: a review//Journal of food protection. — 2021. — Т. 84. — № 12. — С. 2071 — 2083.
16. Niboucha N. et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor//Frontiers in Microbiology. — 2022. — Т. 13. — С. 892181.
17. Roy R. et al. Strategies for combating bacterial biofilms: A focus on anti-biofilm agents and their mechanisms of action//Virulence. — 2018. — Т. 9. — № 1. — С. 522 — 554.