МУ 3.3.2.3972-23. 3.3.2. Медицинские иммунобиологические препараты. Обеспечение безопасности работы со штаммами фиксированного вируса бешенства при производстве иммунобиологических лекарственных препаратов. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 17.10.2023)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["МУ 3.3.1.1099-02"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-mu-3-3-1-1099-02" "МУ 3.3.1.1099-02. 3.3.1. Вакцинопрофилактика. Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства. Методические указания (утв. Минздравом России 15.01."
  n1["МУ 3.3.2.3972-23"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/mu-3-3-2-3972-23" "МУ 3.3.2.3972-23. 3.3.2. Медицинские иммунобиологические препараты. Обеспечение безопасности работы со штаммами фиксированного вируса бешенства при производстве иммунобиологических"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 17 октября 2023 года

3.3.2 МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ РАБОТЫ СО ШТАММАМИ ФИКСИРОВАННОГО ВИРУСА БЕШЕНСТВА ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 3.3.2.3972-23 <*>

<*> МУ 3.3.2.3972-23 введены взамен МУ 3.3.1.1099-02 «Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства», утвержденных Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 15.01.2002.

Методические указания разработаны ФКУН «Российский противочумный институт „Микроб“ Роспотребнадзора (Е.Г. Абрамова, С.В. Генералов, А.К. Никифоров, О.А. Лобовикова, И.В. Шульгина, М.В. Гордеева, И.М. Крепостнова, А.В. Кочкин, Ю.К. Баженова, М.В. Галкина, И.М. Жулидов, Е.А. Усачев, Р.А. Свинцов, А.Г. Селезнева, А.В. Разживин, Н.М. Логинова, В.Н. Панова, М.В. Антонычева, А.Д. Белоусов); ФГБУ „Научный центр экспертизы средств медицинского применения“ Минздрава России (А.А. Мовсесянц, А.Ю. Бутырский, А.В. Мухачева, К.А. Саркисян); АО „НПО „Микроген“, филиал в г. Уфа „Иммунопрепарат“ Госкорпорации Ростех (Е.А. Шаймухаметова, А.Ф. Хазиев, А.Г. Исрафилов).»

I. Область применения и общие положения

1.1. Настоящие методические указания (далее — МУ) описывают принципы безопасности работ с использованием фиксированного вируса бешенства при производстве иммунобиологических лекарственных препаратов (далее — ИЛП), обеспечивающие соблюдение санитарно-эпидемиологических требований <1>.

<1> Глава IV СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).

1.2. Фиксированный вирус бешенства (virus fixe) — аттенуированный штамм вируса бешенства Lyssavirus rabies (род Lyssavirus семейство Rhabdoviridae), полученный путем длительного пассирования через головной мозг лабораторного животного и характеризующийся укороченным и постоянным инкубационным периодом. Фиксированный вирус бешенства вызывает у лабораторных животных паралитическую форму заболевания с инкубационным периодом от 4 до 6 дней, имеет высокую тропность к центральной нервной системе (далее — ЦНС) и низкую тропность к внутренним органам; у незаболевших животных не проникает в слюнные железы и не выделяется вместе со слюной. Паспортизированные штаммы фиксированного вируса бешенства относятся к III группе патогенности <2>.

<2> Приложение 1 СанПиН 3.3686-21.

1.3. Производственными являются штаммы фиксированного Lyssavirus rabies, прошедшие аттестацию для применения в производстве ИЛП, предназначенного для профилактики бешенства у людей.

1.4. К контрольным относятся штаммы фиксированного вируса бешенства, прошедшие аттестацию для применения при контроле качества ИЛП, предназначенные для профилактики бешенства у людей, например штамм фиксированного вируса бешенства CVS.

Перечень основных производственных и контрольных штаммов фиксированного вируса бешенства, используемых для производства и контроля лекарственных препаратов, представлен в таблице.

Таблица

Перечень основных производственных и контрольных штаммов фиксированного вируса бешенства

II. Организация работы со штаммами фиксированного вируса бешенства

Организации

2.1. Организации, в которых проводятся производственные и экспериментальные работы с использованием штаммов фиксированного вируса бешенства, осуществляют деятельность на основании лицензии <3>. Лаборатории, в которых проводятся производственные и экспериментальные работы с использованием штаммов фиксированного вируса бешенства, осуществляют деятельность на основании санитарно-эпидемиологического заключения <4>. Производственные штаммы фиксированного вируса бешенства, используемые при производстве ИЛП, депонируются в государственной коллекции микроорганизмов <5>.

<3> Пункт 19 статьи 12 Федерального закона от 04.05.2011 № 99-ФЗ «О лицензировании отдельных видов деятельности»; пункт 134 главы IV СанПиН 3.3686-21.

<4> Пункт 3 статьи 26 Федерального закона от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»; пункт 135 главы IV СанПиН 3.3686-21.

<5> Статья 11 Федерального закона от 30.12.2020 № 492-ФЗ «О биологической безопасности в Российской Федерации».

2.2. Контроль соблюдения правил биологической безопасности в организации осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <6>.

<6> Пункты 144 — 146 главы IV СанПиН 3.3686-21.

Персонал

2.3. Работу с фиксированным вирусом бешенства выполняют специалисты, допущенные к проведению работ с ПБА III группы в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <7>. Сотрудникам, работающим с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, обязательная профилактическая вакцинация не проводится <8>.

<7> Пункты 149, 151, 320 главы IV СанПиН 3.3686-21.

<8> Приложение 2 приказа Минздрава России от 06.12.2021 № 1122н «Об утверждении национального календаря профилактических прививок, календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям и порядка проведения профилактических прививок».

2.4. Допуск персонала для инженерно-технического сопровождения работ с ПБА осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <9>.

<9> Пункт 150 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.5. Вводный и периодические инструктажи по биологической безопасности персонала, осуществляющего деятельность с фиксированным вирусом бешенства или посещающего «заразную» зону, проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <10>.

<10> Пункты 155, 156 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.6. Сотрудники, работающие с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, проходят периодические медицинские осмотры <11>.

<11> Приказ Минздрава России от 28.01.2021 № 29н «Об утверждении порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров работников, предусмотренных частью четвертой статьи 213 Трудового кодекса Российской Федерации, перечня медицинских противопоказаний к осуществлению работ с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также работам, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры»; приказ Минтруда России и Минздрава России от 31.12.2020 № 988н/1420н «Об утверждении перечня вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные медицинские осмотры при поступлении на работу и периодические медицинские осмотры».

Помещения и оборудование

2.7. Лаборатории, работающие с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, располагаются в отдельно стоящем здании или изолированной части производственного здания с отдельным входом. На входной двери лаборатории обозначаются название (номер) лаборатории и международный знак «Биологическая опасность» <12>.

<12> Пункт 162 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.8. Лаборатории обеспечиваются холодным и горячим водоснабжением, канализацией, электричеством, отоплением и вентиляцией в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <13>.

<13> Глава VIII СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный № 62297), с изменением, внесенным постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 26.06.2021 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 07.07.2021, регистрационный № 64146) (далее — СанПиН 2.1.3684-21).

Устройство, режим работы, эксплуатация систем водоснабжения, канализации, вентиляции «заразной» зоны осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <14>.

<14> Приложение 4 СанПиН 3.3686-21.

2.9. Помещения лаборатории разделяются на «заразную» и «чистую» зоны. Планировочные решения, внутренняя отделка помещений, размещение оборудования, материал для изготовления мебели в «заразной» зоне выполняются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиям <15>.

<15> Глава IV СанПиН 3.3686-21.

2.10. В лаборатории предусматривается набор рабочих и вспомогательных помещений в соответствии с производственной мощностью и номенклатурой выполняемых технологических операций по производству ИЛП <16>.

<16> Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 № 916 «Об утверждении Правил надлежащей производственной практики» (далее — приказ Минпромторга России от 14.06.2013 № 916).

2.11. Во вновь строящихся и реконструируемых подразделениях для поддержания нормируемых параметров микроклимата в рабочих комнатах и боксированных помещениях система приточно-вытяжной вентиляции (далее — ПВВ) оснащается устройствами для кондиционирования воздуха (чиллер/калорифер) и фильтрами очистки воздуха (далее — ФОВ) на входе <17>.

<17> Пункт 331 главы IV, приложение 4 СанПиН 3.3686-21.

Рекомендуется установка сплит-систем. Во время работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства устройства кондиционирования воздуха отключаются. Фильтрующие элементы периодически (не реже 1 раза в 3 месяца) подвергаются дезинфекции и очистке. Сбор конденсата осуществляется в емкость с дезинфицирующим раствором. Сплит-системы в комнатах для содержания зараженных животных не устанавливаются <18>.

<18> Пункт 199 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.12. Работы со штаммами фиксированного вируса бешенства проводятся в боксированных помещениях — боксах микробиологической безопасности (далее — БМБ) не ниже II класса <19>. Работы с высоким риском образования аэрозольных частиц живого вируса (дезинтеграция, гомогенизация мозговых тканей, приготовление суспензий органов, вскрытие черепной коробки, работа с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства) рекомендуется выполнять в БМБ III класса. Работы с высоким риском образования аэрозоля в защитных боксирующих устройствах (далее — ЗБУ) или БМБ не ниже II класса рекомендуется проводить в противочумном костюме IV типа, дополненном защитным щитком или защитными противотравматическими очками, респиратором не ниже класса FFP2.

<19> Пункт 333 главы IV СанПиН 3.3686-21.

Проверка эксплуатационных характеристик БМБ осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <20>.

<20> Пункт 188 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.13. Площадь помещения для безопасного проведения работ со штаммами фиксированного вируса бешенства должна соответствовать санитарно-эпидемиологическим требованиям <21>.

<21> Пункт 166 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.14. В работе с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства используются технически исправные аттестованные и прошедшие метрологическую поверку приборы, оборудование и средства измерений <22>. На каждый прибор (установку) разрабатываются правила (инструкция) по их эксплуатации.

<22> Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 № 916.

Содержание лабораторных животных

2.15. Устройство, оборудование и содержание вивариев осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <23>.

<23> Пункты 239 — 243 Глава IV СанПиН 3.3686-21.

2.16. Кроликов, зараженных производственными штаммами фиксированного вируса бешенства, рекомендуется содержать в клетках открытого типа.

2.17. Чистка клеток после содержания в них зараженных животных осуществляется жидкими дезинфицирующими средствами, разрешенными к применению в Российской Федерации <24>. Сухие отходы (например, остатки корма, подстилка) замачиваются в дезинфицирующем растворе в соответствии с п. 6.3.

<24> Таблицы 3, 6 приложения 2 СанПиН 3.3686-21.

2.18. Учет движения животных осуществляется в специальном журнале с указанием даты заражения, наименования штамма, заражающей дозы, способа аппликации, номера животного <25>.

<25> Пункты 482, 484 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.19. Клетки с зараженными животными маркируются этикетками, на которых указывается дата заражения, наименование штамма, заражающая доза, способ введения вируса, номер животного, фамилия и инициалы специалиста, работающего с ПБА <26>.

<26> Пункт 258 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.20. Посещение блока для работы с инфицированными животными регистрируется в журнале в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <27>.

<27> Пункт 255 главы IV СанПиН 3.3686-21.

Проведение работ с производственными и контрольными штаммами фиксированного вируса бешенства

2.21 В помещениях «заразной» зоны осуществляются следующие виды работ:

• работа с животными (заражение, вскрытие);
• содержание инфицированных животных;
• дезинтеграция, гомогенизация мозговых тканей и другие операции с вероятным образованием аэрозоля;
• заражение культуры клеток;
• приготовление взвесей и суспензий;
• работа с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;
• хранение производственных штаммов вируса бешенства и объектов, их содержащих.

2.22 В помещениях «заразной» зоны не рекомендуется:

• оставлять после окончания работы на рабочих местах посуду с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;
• хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, зонты, хозяйственные сумки, косметику, а также продукты питания;
• принимать пищу, пить воду, курить;
• оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любого вида работ с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства;
• сливать жидкие отходы (инфицированные жидкости, исследуемый материал) в канализацию без предварительного обеззараживания.

2.23. Во время работы двери рабочих комнат закрываются. Перед работой включается вытяжная вентиляция. Выход из рабочей комнаты во время проведения работы не рекомендуется.

2.24. Для дезинфекции используются дезинфекционные средства, разрешенные к применению в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <28>.

<28> Пункт 84 главы III СанПиН 3.3686-21.

2.25. Заражение животных фиксированным вирусом бешенства осуществляется не менее чем двумя сотрудниками <29>.

<29> Пункт 204 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.26. При пипетировании вируссодержащих жидкостей рекомендуется пользоваться лабораторными грушами или автоматическими устройствами с наконечниками, оснащенными фильтрами. Не рекомендуется переливание жидких культур через край сосуда (пробирки, колбы, флакона), продувание через них воздуха из пипеток.

2.27. Перед использованием посуда, пипетки, оборудование, шприцы проверяются на целостность и исправность.

2.28. По окончании работы все объекты с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства помещаются в опечатываемые хранилища (холодильники, термостаты, шкафы); проводится текущая дезинфекция рабочих поверхностей путем протирания или, в случае труднодоступных поверхностей, орошения с применением дезинфицирующих растворов в соответствии с п. 6.3 и обеззараживания воздуха и поверхностей бактерицидными лампами. Длительность использования бактерицидных ламп зависит от их мощности и площади поверхностей и рассчитывается индивидуально <30>.

<30> Пункт 7.1, приложение 5 Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях», утвержденное Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 04.03.2004 (далее — Р 3.5.1904-04).

2.29. Использованные пипетки погружаются в дезинфицирующий раствор, избегая образования в каналах пузырьков воздуха. Груши и иные механические устройства для пипетирования зараженного материала обрабатываются в соответствии с приложением 1 к настоящим МУ.

2.30. Использованная посуда, отходы из «заразной» зоны собираются в закрывающиеся емкости. Указанные объекты подвергаются обеззараживанию с применением паровой стерилизации (приложение 1 к настоящим МУ). Сбор, хранение и утилизация отходов осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <31>.

<31> Пункт 212 главы IV СанПиН 3.3686-21; глава X СанПиН 2.1.3684-21.

2.31. Перенос производственных штаммов фиксированного вируса бешенства и использованной посуды для обеззараживания осуществляется в плотно закрытых емкостях.

2.32. Хранение, учет, передача, транспортирование и уничтожение производственных штаммов фиксированного вируса бешенства производится в соответствии с санитарно-эпидемиологическим требованиями <32>.

<32> Пункты 484 — 535 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.33. Вынос из лаборатории (например, оборудования, лабораторной или хозяйственной посуды, инструментов) осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <33>.

<33> Пункт 208 главы IV СанПиН 3.3686-21.

2.34. Экспериментальные и производственные работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства рекомендуется проводить в одном помещении при разделении этих работ во времени и проведении текущей дезинфекции после каждого цикла работ. Не рекомендуется совместное хранение материалов для производственных и экспериментальных работ. Для проведения производственных и экспериментальных работ при необходимости проводится инактивация производственного штамма вируса бешенства (приложение 2 к настоящим МУ).

2.35 В помещениях «чистой» зоны лаборатории предусматриваются следующие виды работ:

• проведение подготовительных работ (например, обработка и стерилизация посуды, приготовление питательных сред);
• ведение производственной документации;
• хранение чистой посуды, уборочного и вспомогательного инвентаря, СИЗ;
• хранение питательных сред, диагностических препаратов, дезинфицирующих средств, медицинской аптечки.

III. Штаммы фиксированного вируса бешенства

3.1. Культивирование штаммов фиксированного вируса бешенства осуществляется на лабораторных животных или клеточных культурах с регистрацией истории пассажей. Для культивирования определенного штамма фиксированного вируса бешенства рекомендуется использовать один и тот же вид животного или клеточной культуры.

3.2. Для обеспечения безопасности работ и качества получаемого лекарственного препарата рекомендуются следующие характеристики штаммов фиксированного вируса бешенства:

• минимальная вирулентность для лабораторных животных при экстраневральном введении — не более 10-1,5 LD50/мл при внутримышечном и подкожном путях заражения белых мышей [1];
• антигенная специфичность и иммуногенная активность.

Количество пассажей для производственного вируса бешенства регламентируется в соответствии с инструкцией по применению ИЛП [1];

Фиксированный вирус бешенства при воспроизводстве на животных имеет следующие основные признаки:

• короткий инкубационный период (4 — 6 дней);
• патогенность для животных (кроликов, белых мышей) при интрацеребральном заражении;
• способность вызывать паралитическую форму бешенства;
• высокую тропность к ЦНС и низкую тропность к внутренним органам.

Каждый производственный штамм вируса бешенства имеет паспорт, в котором отражается история его выделения, видовая идентификация, наличие посторонних агентов, ведущие биологические свойства, условия хранения, условия пассирования (культуральные свойства), условия получения посевного вирусного материала (число пассажей). Паспорт на контрольный штамм вируса бешенства содержит информацию, отражающую результаты его аттестации. Производственные штаммы фиксированного вируса бешенства органо-тканевой и культуральной природы нейтрализуются иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не нейтрализуются сывороткой крови крупного рогатого скота нормальной. Индекс нейтрализации составляет не менее 100 [1].

Рекомендуемый титр производственных штаммов вируса бешенства — не менее 10-6 LD50/мл при интрацеребральном заражении беспородных белых мышей или мышей любой инбредной линии соответствующих возраста и массы, обозначенных в НД на лекарственный препарат. При этом учитывается, что лабораторные животные могут быть нечувствительны к вирусу, пассируемому на культуре клеток экстраневрального происхождения. В этом случае активность вируса рекомендуется исследовать на культуре клеток, чувствительной к данному штамму вируса бешенства.

Производственные штаммы вируса бешенства способны обеспечивать иммуногенные свойства, достаточные для образования защитных антител. Рекомендуемая активность составляет не менее 1,0 МЕ [2].

3.3. Производство ИЛП для профилактики бешенства основано на системе посевных материалов (англ. seed lot system), включающей главный посевной материал и рабочий посевной материал производственных штаммов фиксированного вируса бешенства. Главный посевной материал — вируссодержащий материал (органо-тканевого или культурального происхождения), полученный от исходного вируса, расфасованный в ампулы в процессе одной операции таким образом, чтобы обеспечить однородность, стабильность и предупредить контаминацию чужеродными микроорганизмами. Рабочий посевной материал — вируссодержащий материал (органо-тканевый или на культуре клеток), полученный из главного посевного материала и предназначенный для использования в производстве. Главный и рабочий посевной вирусный материал не содержит бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза, посторонних вирусных агентов, грибов и микоплазм.

3.4. Для проверки идентичности штаммов вируса, поддерживаемых в отдельных лабораториях и применяемых в производстве антирабических препаратов, могут использоваться моноклональные антитела и метод геномного определения последовательности аминокислотных остатков в белках [3, 4].

IV. Работа с объектами, содержащими фиксированный вирус бешенства

4.1. Работы по вскрытию ампул с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства проводятся в условиях БМБ не ниже II класса <34>. Ампулы с лиофилизированными производственными штаммами фиксированного вируса бешенства вскрываются стерильно над подносом или лотком с марлевой салфеткой, пропитанной дезинфицирующим раствором. Верхний конец ампулы нагревается над пламенем горелки, снимается парафин, затем кусочком стерильной ваты, смоченным в стерильной воде, осторожно прикасаются к оттянутому концу ампулы для образования трещины, затем обводят вокруг носика ампулы. После образования круговой (или не полностью круговой) трещины конец ампулы накрывается марлевой салфеткой или ватой и обламывается пинцетом. После отделения верхнего конца в ампулу добавляется 1 мл стерильной воды очищенной, содержащей сыворотку крови лошади нормальную инактивированную в конечной концентрации 2% и осторожно перемешивается. Полученная суспензия, содержащая фиксированный вирус бешенства, используется для заражения лабораторных животных <35>.

<34> Пункт 333 главы IV СанПиН 3.3686-21.

<35> Пункт 38(23) приложения 2 к приказу Минпромторга России от 14.06.2013 № 916; ГОСТ 33215 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», введенный приказом Росстандарта от 09.11.2015 № 1732-ст.

4.2. Манипуляции с фиксированным вирусом бешенства на лабораторных животных осуществляются в соответствии с приложением 3 к настоящим МУ.

4.3. Применение клеточных культур для производства и контроля ИЛП основано на системе создания главного и рабочего банков клеток, охарактеризованных в соответствии с положениями государственной фармакопеи Российской Федерации [5].

Главный банк клеток — запас клеток, полученных из одного посевного пула клеток однородного состава на определенном уровне пассажа, сохраняемых в контейнерах в равных частях при температуре не выше минус 70 °C. Главный банк клеток предназначен для последующего создания рабочего банка клеток.

Рабочий банк клеток — запас клеток однородного состава, полученных из главного банка клеток на определенном уровне пассажа, сохраняемых в контейнерах в равных частях при температуре не выше минус 70 °C. Клетки рабочего банка используются для получения производственной клеточной культуры.

4.4. Работа с фиксированным вирусом бешенства на первичных клеточных культурах осуществляется в соответствии с приложением 4 к настоящим МУ.

4.5. Работа с фиксированным вирусом бешенства на клетках перевиваемых линий.

Клеточная перевиваемая культура, используемая для репродукции фиксированного вируса бешенства, имеет типичную морфологию для данной линии, обладает высокой чувствительностью к заражению вирусом бешенства, сохраняет стабильность биологических свойств. Для выполнения работ по культивированию вируса бешенства на перевиваемых клеточных линиях экстраневрального происхождения (например, Vero) предварительно проводят адаптацию вируса к клеткам данных линий на протяжении не менее 20 — 30 пассажей до достижения необходимого уровня инфекционного титра. Следует отметить, что культуры клеток, полученные из мозговой ткани различных животных, например культура клеток Neuro-2a, не требуют предварительной адаптации к ним аттенуированного вируса бешенства.

В качестве перевиваемой линии клеток обычно используют культуру клеток Vero или любую другую чувствительную культуру клеток (см. табл.), полученную из официальной коллекции клеточных культур с приложением паспорта.

Культивирование фиксированного вируса бешенства на клетках перевиваемых линий осуществляют несколькими методами: стационарным, суспензионным, псевдосуспензионным (на микроносителях), роллерным. Указанные методы с использованием клеток перевиваемых линий в настоящее время применяются при проведении экспериментальных исследований, осуществляемых в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <36>.

<36> Глава IV СанПиН 3.3686-21.

Для наработки монослойной клеточной культуры используют хранящиеся в жидком азоте ампулы рабочего банка клеток. Для формирования монослоя клетки перевиваемой линии после размораживания вносят в культуральный флакон с ростовой питательной средой, рекомендуемой паспортом на используемую клеточную культуру.

Заражение вирусом клеток перевиваемой линии осуществляют в монослой или в суспензию (приложение 4 к настоящим МУ). При инокуляции вируса в клеточную суспензию клетки перевиваемой линии предварительно открепляют от поверхности флакона с помощью раствора версена и трипсина (соотношение 2:1) и суспендируют в питательной среде. Оптимальная концентрация клеток составляет (0,5 — 1,0) x 106 кл/мл. К клеточной суспензии добавляют вируссодержащую жидкость в инфицирующей дозе от 0,1 до 1 ИД50 на 1 клетку.

Сроки и условия культивирования фиксированного вируса бешенства в клетках перевиваемых линий могут отличаться в зависимости от используемых штаммов вируса бешенства и клеточной культуры. На протяжении срока инкубации следует ежедневно оценивать состояние клеточной культуры. Об окончании культивирования вируса бешенства судят по деградации монослоя после его истощения при исследовании методом микроскопии. После завершения культивирования вируссодержащую жидкость центрифугируют при 500 g в течение 5 мин для удаления остатков клеток и используют для дальнейших манипуляций.

V. Использование средств индивидуальной защиты

5.1. Сотрудники лаборатории для проведения работ в «заразной» зоне обеспечиваются рабочей одеждой (пижамами (комбинезонами), медицинскими халатами, шапочками, сменной рабочей обувью) и СИЗ в зависимости от характера выполняемых работ в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <37>.

<37> Приложение 3 СанПиН 3.3686-21.

5.2. Рабочая одежда и обувь являются индивидуальными, соответствуют размерам работающих сотрудников и хранятся отдельно от личной одежды. Смена рабочей одежды проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <38>.

<38> Пункт 235 главы IV СанПиН 3.3686-21.

5.3. При проведении работ, связанных с заражением животных производственными штаммами, используются противочумный халат и шапочка или защитный комбинезон с капюшоном, фартук из прочного водонепроницаемого материала, медицинские перчатки, защитные щитки (экраны), респиратор не ниже FFP2 класса защиты. Работы по вскрытию черепной коробки проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <39>.

<39> Приложение 3 СанПиН 3.3686-21.

5.4. Перед сдачей в стирку защитная одежда многоразового применения обеззараживается путем погружения в 3%-й раствор хлорамина Б на 30 мин или 1%-й раствор хлорамина Б на 1 ч <40> или физическими методами в соответствии с приложением 1 к настоящим МУ.

<40> Примечание: допускается использование дезинфицирующих средств с аналогичными или лучшими характеристиками.

VI. Обеззараживание материала и уборка помещений

6.1. Обеззараживание защитной одежды, лабораторной посуды, инструментов, отходов, поверхностей мебели, помещений проводится физическим или химическим методом. Методы и средства обеззараживания определяются в зависимости от характера обеззараживаемого объекта <41>.

<41> Пункт 3 главы I СанПиН 3.3686-21.

6.2. Обеззараживание защитной одежды, лабораторной посуды, инструментов, отходов, поверхностей мебели, помещений физическим методом проводится согласно режимам, указанным в приложении 1 к настоящим МУ.

6.3. Обеззараживание защитной одежды, лабораторной посуды, инструментов, отходов, поверхностей мебели, помещений химическим методом проводится согласно инструкции по применению дезинфицирующих средств, представленных производителем.

Для химической дезинфекции рекомендуется использовать следующие хлорактивные и кислородактивные соединения, спирты и щелочи:

1. хлорактивные соединения:

• хлорамин (содержание активного хлора не менее 24%) — 1 - 4%-е (по препарату) растворы; 0,5%-й, 1,5%-й (по препарату) активированные растворы хлорамина (в качестве активаторов хлорных препаратов могут использоваться аммонийные соли (хлорид, сульфит или нитрат аммония) в соотношении с хлорным препаратом 1 : 1 или 1 : 2 или аммиак в соотношении с хлорактивным средством 1 : 8),
• гипохлорит кальция (содержание активного хлора 45 — 54%): 15%-е осветленные растворы, содержащие не менее 5% активного хлора,
• дезинфицирующие средства на основе натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты (таблетки, гранулы),
• дезинфицирующие средства на основе трихлоризоциануровой кислоты (например, таблетки, гранулы);

2. кислородактивные соединения:

• водорода перекись (содержание перекиси водорода не менее 30%) — 3%-й, 6%-й и 10%-й растворы (по перекиси водорода),
• водорода перекись медицинская с моющим средством — 3%-й, 6%-й и 30%-й растворы перекиси водорода с 0,5% моющего средства;
• 3%-й, 6%-й и 30%-й (по перекиси водорода) растворы;

3. спирты:

• спирт этиловый (не менее 70% по массе);

4. щелочи:

• гидроксид натрия натр едкий (4%-й водный раствор).

Не рекомендуется совместное использование перекись- и хлорсодержащих дезинфицирующих растворов для проведения работ с ПБА, а также их хранение в одном помещении и слив с накоплением в одной емкости.

6.4. Дезинфекцию изделий медицинского назначения и лабораторной посуды проводят способом погружения в раствор дезинфицирующего средства. Разъемные изделия дезинфицируются в разобранном виде. Каналы и полости изделий заполняются дезинфицирующим раствором.

6.5. Дезинфекция металлических ящиков, садков, бачков из-под вскрытых животных проводится способами протирки в соответствии с режимами, рекомендованными для обеззараживания поверхностей, или способом погружения.

Не рекомендуется обеззараживание биологических отходов (тушек лабораторных животных) СВЧ-излучением.

6.6. При хранении дезинфицирующих средств непосредственно в помещении для работы с ПБА не рекомендуется превышать их количество больше необходимого для непрерывного обеспечения текущей работы.

6.7. Контроль концентрации рабочих растворов дезинфицирующих средств осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <42>.

<42> Пункт 223 главы IV СанПиН 3.3686-21.

6.8. Перенос растворов дезинфицирующих веществ внутри подразделения производится в специальных емкостях с плотно прилегающими крышками.

6.9. Емкости с приготовленным дезинфицирующим раствором маркируются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <43>.

<43> Пункт 222 главы IV СанПиН 3.3686-21.

6.10. Текущая и генеральная уборка осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <44>. Заключительная дезинфекция помещений проводится по завершении производственного цикла работ перед периодом отпусков. Дезинфекции, в том числе с применением аэрозольного метода, подвергаются поверхности лабораторной мебели, приборов, оборудования, стен, потолка. После заключительной дезинфекции в помещениях проводится влажная уборка с применением моющих средств. После влажной уборки включаются бактерицидные лампы.

<44> Пункт 229 главы IV СанПиН 3.3686-21.

6.11. Уборочный инвентарь маркируется отдельно для «чистой» и «заразной» зон, не рекомендуется перенос его из зоны в зону. Уборочный инвентарь для помещений «заразной» зоны маркируется в соответствии с назначением, используется и хранится раздельно для каждого помещения «заразной» зоны.

6.12. Обработка бактерицидных ламп осуществляется в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <45>.

<45> Пункт 231 главы IV СанПиН 3.3686-21.

VII. Мероприятия при локализации и ликвидации последствий аварий <46>

<46> Пункты 270 — 292 главы IV СанПиН 3.3686-21.

7.1. Для проведения мероприятий по ликвидации последствий аварии в подразделении, проводящем работу с фиксированным вирусом бешенства, в специально отведенном месте хранится аварийная аптечка, комплекты рабочей одежды для переодевания находившихся в зоне аварии сотрудников, комплекты защитной одежды для аварийной бригады, гидропульт, аварийный запас дезинфицирующего средства, активного в отношении фиксированного вируса бешенства, запас воды.

Места нахождения аварийных комплектов маркируются различимой надписью.

Аварийная аптечка укомплектовывается в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <47>. В лаборатории, где проводится работа с фиксированным вирусом бешенства, имеется в наличии интерферон или индуктор интерферона <48>.

<47> Пункт 271 главы IV СанПиН 3.3686-21.

<48> Пункт 272 главы IV СанПиН 3.3686-21.

Объем мероприятий по ликвидации аварии зависит от характера выполняемой работы, вида и свойств возбудителя, масштабов аварии.

7.2. План ликвидации аварий при работе с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства разрабатывается в соответствии с санитарно-эпидемиологическим требованиями <49>.

<49> Пункт 147 главы IV СанПиН 3.3686-21.

В случае аварии сотрудники, работающие с фиксированным вирусом бешенства, действуют в соответствии с разработанным планом ликвидации аварии и санитарно-эпидемиологическими требованиями <50>.

<50> Пункты 276 — 279, 284, 285 главы IV СанПиН 3.3686-21.

Дальнейшие мероприятия по локализации аварии и устранению ее последствий и принятие решения о возобновлении работ с фиксированным вирусом бешенства также осуществляются в соответствии с разработанным планом ликвидации аварии и санитарно-эпидемиологическими требованиями <51>.

<51> Пункты 286 — 294 главы IV СанПиН 3.3686-21.

7.3. При авариях с ранением или попаданием вируссодержащей жидкости на слизистые оболочки проводят профилактическую вакцинацию против бешенства. Курс иммунизации с использованием антирабической вакцины и, при необходимости, антирабического иммуноглобулина проводится согласно инструкциям по их применению.

Приложение 1 к МУ 3.3.2.3972-23

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЮ ФИЗИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ РАЗЛИЧНЫХ ОБЪЕКТОВ, КОНТАМИНИРОВАННЫХ ФИКСИРОВАННЫМ ВИРУСОМ БЕШЕНСТВА

Приложение 2 к МУ 3.3.2.3972-23

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИНАКТИВАЦИИ ШТАММОВ ФИКСИРОВАННОГО ВИРУСА БЕШЕНСТВА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАБОТ

<52> Раздел 10.2 ГОСТ 26075 «Животные. Методы лабораторной диагностики бешенства», введенный приказом Росстандарта от 09.11.2015 № 1732-ст (далее — ГОСТ 26075).

<53> Раздел 10.2 ГОСТ 26075.

<54> Раздел 10.2 ГОСТ 26075.

<55> Приложение 1 МУ 1.3.3103-13 «Организация работы лабораторий, использующих методы электронной и атомно-силовой микроскопии при исследовании культур микроорганизмов I — IV групп патогенности», утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 16.08.2013.

<56> Раздел 10.2 ГОСТ 26075.

<57> Раздел 10.2 ГОСТ 26075.

<58> Пункт 3.3 приложения 5 МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности», утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009.

Приложение 3 к МУ 3.3.2.3972-23

МЕТОДЫ РАБОТЫ С ФИКСИРОВАННЫМ ВИРУСОМ БЕШЕНСТВА НА ЖИВОТНЫХ НА ПРИМЕРЕ ШТАММОВ «МОСКВА 3253» И CVS

1.1. Условия хранения и пассирования производственного штамма фиксированного вируса бешенства (штамм «Москва 3253») на кроликах.

Главный посевной материал (лиофилизированный штамм «Москва 3253») хранится в ампулах в виде 10%-й суспензии ткани мозга кролика при температуре не выше минус 20 °C. После вскрытия ампулы вирус пассируется 2 — 3 раза через мозг кролика. После проведенных пассажей инкубационный период и клиническая картина являются типичными для лабораторного бешенства. После пассажей на кроликах штамм фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» хранится в виде замороженного головного мозга кролика (для приготовления маточной культуры вируса и производственного рабического антигена) или в виде замороженной 10%-й суспензии ткани мозга (рабочий посевной материал). Оптимальной температурой для хранения является температура не выше минус 70 °C. Для хранения используется низкотемпературный холодильник или криогенные сосуды с жидким азотом.

Штамм фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» пассируется через головной мозг кролика не чаще 6 — 7 раз в год после третьего пассажа от исходного лиофилизированного. Для заражения рекомендуется использовать аутбредных кроликов породы «советская шиншилла» массой 1,5 — 2,0 кг без различия пола.

Работу с животными проводят сотрудники, прошедшие инструктаж по мерам безопасности и имеющие навыки работы с животными. Перед заражением кроликов замороженную аликвоту с 10%-й мозговой суспензией выдерживают при температуре плюс (6 +/- 2) °C в течение 18 — 20 ч для оттаивания и осаждения мозговой ткани, после чего осторожно пастеровской пипеткой отбирают среднюю фазу мозговой суспензии, содержащую максимальное количество вируса. Заражение животных производят с соблюдением правил хирургической асептики. Кроликов заражают в мозг или под твердую мозговую оболочку. Для внутримозгового заражения кролика его надежно фиксируют на станке или дают легкий наркоз внутримышечно за 20 — 30 мин до заражения. Затем аккуратно выстригают шерсть в зоне предполагаемого введения, обрабатывают 70%-м этиловым спиртом и с помощью стерильного шприца однократного применения емкостью 2 мл вводят (0,25 +/- 0,05) мл суспензии фиксированного вируса бешенства. Прокол делают приблизительно на середине линии, условно соединяющей наружный угол глаза и ухо (с правой стороны или симметрично с левой стороны). Явные признаки паралича появляются у кроликов на 4-й день после инокуляции; в редких случаях они развиваются до 7-го дня. К числу первых симптомов экспериментального бешенства относятся: повышение температуры тела; пугливость животного; расширение зрачков. Затем появляются менингеальные явления, парезы, начинающиеся обычно с задних конечностей, быстро прогрессирующие параличи, захватывающие все конечности, шейную и затылочную мускулатуру.

Для приготовления вируссодержащего материала используются животные, заболевшие не ранее чем через 80 ч и не позднее 144 ч после заражения. Извлечение мозга у животного производится после развития полной картины паралича, характерного для заражения фиксированным вирусом бешенства. Регламентные работы по декапитации больных кроликов проводят в боксированном помещении «заразной» зоны с соблюдением санитарно-эпидемиологических требований <59>. Больных кроликов с полной картиной паралича, но с еще сохранившимся дыханием, декапитируют; с помощью пинцета, скальпеля и ножниц отсепаровывают кожу головы. Обнаженную поверхность черепа дважды обрабатывают 70%-м раствором этилового спирта, череп помещают в емкость с крышкой, которую передают в БМБ III класса для вскрытия черепной коробки и извлечения головного мозга. Перед вскрытием череп двукратно обрабатывают тампоном, смоченным в 70%-м растворе этилового спирта. Череп кролика надежно фиксируют на станке и проводят трепанацию с помощью хрящевого реберного ножа и хирургического молотка. Делают четыре разруба, образующих прямоугольник в теменной области черепа, и обнажают головной мозг. С помощью пинцета и ножниц с загнутыми концами освобождают мозг от спаек, затем перерезают мозг на уровне спинного мозга и перекреста зрительных нервов. Головной мозг извлекают из черепной коробки, помещают в стерильную чашку Петри, взвешивают и используют для приготовления рабочего посевного вирусного материала для проведения пассажей на кроликах, а также для изготовления производственного рабического антигена для гипериммунизации животных-продуцентов.

<59> Пункт 252 главы IV СанПиН 3.3686-21.

1.2. Для приготовления рабочего посевного вирусного материала для заражения кроликов («маточной» культуры фиксированного вируса бешенства «Москва 3253») головной мозг кролика после оттаивания помещают в стерильную фарфоровую ступку, растирают стерильным фарфоровым пестиком, добавляют стерильную воду очищенную до конечной концентрации суспензии 10%. Суспензию ткани мозга кролика аликвотируют по 10 мл и помещают на хранение. Работу проводят в БМБ III класса (см. п. 2.12 настоящих МУ).

1.3. Для приготовления производственного антигена для гипериммунизации животных-продуцентов к головному мозгу кролика после оттаивания и измельчения добавляют очищенную воду, содержащую 0,5% фенола в количестве, необходимом для получения 5%-й и 10%-й мозговой суспензии, в зависимости от этапа иммунизации продуцентов. Для удаления крупных остатков мозговой ткани суспензию мозга фильтруют через тройной слой стерильной марли. Для проведения контроля стерильности с помощью бактериологической петли проводят посев образца рабического антигена из ступки в пробирки с сахарным бульоном. Посевы выдерживают при температуре плюс (37 +/- 1) °C в течение 5 суток. Стерильный антиген, приготовленный на карболизированной воде, инактивируют при температуре плюс (37 +/- 1) °C в течение 1 суток или при температуре плюс (6 +/- 2) °C в течение 8 суток. Разрешается к использованию стерильный антиген, хранившийся при температуре плюс (6 +/- 2) °C не более 14 суток.

1.4. Условия хранения и пассирования контрольного штамма фиксированного вируса бешенства (штамм CVS) на белых мышах.

Главный посевной материал (лиофилизированный штамм CVS) хранят в ампулах в виде 20%-й суспензии ткани мозга мыши при температуре не выше минус 20 °C. После вскрытия ампулы вирус пассируют 1 — 3 раза через мозг белой мыши. После проведенных пассажей инкубационный период и клиническая картина болезни соответствуют типичному лабораторному бешенству. После пассажей на белых мышах штамм фиксированного вируса бешенства CVS хранят в виде замороженного головного мозга мыши (для приготовления маточной культуры вируса) или в виде замороженной 20%-й суспензии ткани мозга (материал для постановки контрольных реакций). Оптимальной температурой для хранения является температура не выше минус 70 °C. Для хранения используют низкотемпературный холодильник или криогенные сосуды с жидким азотом.

Перед заражением белых мышей штаммом CVS содержимое криопробирки с замороженной вирусной суспензией быстро оттаивают, после чего осаждают мозговую ткань центрифугированием в течение 5 мин при 500 g. Для заражения используют беспородных белых мышей или мышей любой инбредной линии в возрасте 6 — 8 недель и массой (11 +/- 1) г. Пол мышей принципиального значения не имеет. Мышь укладывают головой на подставку и надежно, но не сильно, чтобы не вызвать асфиксию, фиксируют пальцами. Заражение проводят с помощью инсулинового шприца объемом 0,3 — 1,0 мл (цена деления 0,01). Тампоном, смоченным 70%-м раствором этилового спирта, тщательно обрабатывают место введения вируса. Иглой шприца в строго вертикальном положении прокалывают череп животного в точке, находящейся в вершине воображаемого угла, стороны которого ведут к правому глазу и правому уху животного (или симметрично с левой стороны). Иглу погружают на 0,1 — 0,2 см в ткань мозга и вводят 0,03 мл вирусной суспензии. После заражения шприц погружают в емкость с дезраствором, предварительно движением поршня заполнив его дезраствором.

На 5 — 6 день после заражения у мышей появляются симптомы заболевания: взъерошенная шерсть; тремор при поднятии животного за кончик хвоста; нарушение координации движений задних конечностей; паралич; прострация (терминальный синдром). Мышей с выраженными терминальными симптомами лабораторного бешенства, но еще живых, подвергают эвтаназии и далее проводят манипуляции по извлечению головного мозга.

Животное фиксируют животом вниз, прикрепив вытянутые конечности, хвост и конец морды. После обработки 70%-м раствором этилового спирта кожу головы и шеи отсепаровывают с помощью стерильных ножниц и пинцета, открывая череп. Череп зажимают в глазницах хирургическим пинцетом, изогнутыми ножницами отделяют крышку черепа, обнажая мозг. С помощью тех же изогнутых ножниц извлекают мозг, помещают его в криопробирку, маркируют и помещают на хранение при температуре не выше минус 70 °C, в дальнейшем используя для приготовления 20%-й мозговой суспензии. Одновременно проводят посев на стерильность в пробирки с сахарным бульоном, которые инкубируют при температуре плюс (37 +/- 1) °C в течение 5 суток. Для испытания на стерильность используется тиогликолевая среда, посевы инкубируются в течение 14 суток при двух температурных режимах: плюс (32,5 +/- 2,5) °C и (22,5 +/- 2,5) °C. Для получения посевного вирусного материала стерильную мозговую ткань в условиях БМБ III класса тщательно растирают в фарфоровой ступке стерильным пестиком и готовят 20%-ю суспензию, постепенно добавляя суспензионную среду (стерильную воду очищенную, содержащую сыворотку крови лошади инактивированную в конечной концентрации 2%).

Приложение 4 к МУ 3.3.2.3972-23

МЕТОДЫ РАБОТЫ С ФИКСИРОВАННЫМ ВИРУСОМ БЕШЕНСТВА НА ПЕРВИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ НА ПРИМЕРЕ ШТАММА «ВНУКОВО-32»

1.1. Работа с фиксированным вирусом бешенства (штамм «Внуково-32») на первичных клеточных культурах.

Штамм фиксированного вируса бешенства «Внуково-32» применяется в производстве вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной для профилактики бешенства у людей. Для изготовления антирабической вакцины используют главный посевной материал и рабочий посевной материал производственного штамма «Внуково-32» фиксированного вируса бешенства, полностью охарактеризованный в соответствии с положениями государственной фармакопеи Российской Федерации [2]. Количество пассажей полностью охарактеризованного главного посевного вирусного материала для получения рабочего посевного вирусного материала, используемого для производства антирабических препаратов, не превышает 5. Количество пассажей рабочего посевного вирусного материала, используемого для производства антирабических препаратов, рассчитывается в соответствии с инструкцией по применению ИЛП.

Для приготовления первично-трипсинизированной культуры клеток почек сирийских хомячков в качестве источника тканей используют здоровых животных, подвергнутых испытаниям на отсутствие трансмиссивных вирусных инфекций, из специализированных питомников с приложением ветеринарного свидетельства.

Перед изъятием органов и тканей животное умерщвляют, поверхность тела подвергают дезинфекции, затем в асептических условиях извлекают почки. Органы животных измельчают, промывают от крови и объединяют в пул, который подвергают воздействию трипсина при постоянном перемешивании. Для прекращения воздействия трипсина в пул добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота в конечной концентрации 10%. Полученные клетки отмывают от трипсина центрифугированием при 500 g в течение 5 мин, по окончании центрифугирования клетки немедленно суспендируют и контролируют концентрацию клеток методом микроскопии с использованием камеры Горяева или счетчика клеток.

Заражение первичных клеток фиксированным вирусом бешенства возможно двумя вариантами: заражение вирусом сформированной монослойной культуры клеток или заражение суспензии клеток с последующим внесением зараженной суспензии в культуральный флакон для формирования монослоя.

Для формирования монослойной культуры используют питательную среду 199, содержащую гидролизат лактальбумина и сыворотку крови крупного рогатого скота.

Монослой клеточной культуры, предназначенный для заражения вирусом, закрывает 70 — 90% рабочей поверхности культурального флакона. Контроль клеточной культуры осуществляют с помощью инвертированного микроскопа. Перед инокуляцией вируса бешенства в клеточный монослой из культурального флакона полностью удаляют питательную среду. Монослой однократно промывают раствором Дульбекко или питательной средой, которые затем удаляют. В культуральный флакон стерильной пипеткой вносят вируссодержащую жидкость. Объем вирусного материала определяют таким образом, чтобы он равномерно покрывал весь монослой, а доза заражения составила от 0,1 до 1 ИД50 на 1 клетку. Перекатывающими движениями равномерно распределяют вируссодержащую жидкость по монослою и инкубируют не менее 30 мин в CO2-инкубаторе при температуре 37 °C для адсорбции вируса. Рекомендуется через каждые 10 — 15 мин покачивать культуральные флаконы. После завершения адсорбции вируссодержащую жидкость с помощью пипетки или автоматического дозатора удаляют из флакона в емкость с дезсредством (3%-й раствор хлорамина Б или 3%-й раствор перекиси водорода <60>).

<60> Примечание: допускается использование дезинфицирующих средств с аналогичными или лучшими характеристиками.

При инокуляции вируса в клеточную суспензию свежетрипсинизированные клетки заражают вирусом при множественности заражения от 0,1 до 1 ИД50 на 1 клетку.

Для наработки вирусного полуфабриката для производства вакцинного препарата в культуральный флакон после заражения вносят питательную среду 199, содержащую гидролизат лактальбумина, дополнительно обогащенный подходящим гидролизатом белков или ростовые протеины.

Культивирование вируса бешенства проводят при температуре плюс 32 — 37 °C в течение 3 — 4 недель с периодической сменой питательной среды 2 — 3 раза в неделю. Об окончании культивирования вируса бешенства судят по деградации монослоя после его истощения при исследовании методом микроскопии.

Собранную из культуральных флаконов вируссодержащую культуральную жидкость по окончании культивирования объединяют и подвергают концентрированию методом ультрафильтрации и очистке методом диафильтрации. Сконцентрированный и очищенный вирусный полуфабрикат подвергают инактивации под действием ультрафиолетового облучения в тонком слое вирусной суспензии при постоянной скорости протока суспензии через аппарат инактивации или внесением бета-пропиолактона, а далее используют для завершающих стадий очистки и приготовления антирабической вакцины [2].

Нормативные и методические документы

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Федеральный закон от 30.12.2020 № 492-ФЗ «О биологической безопасности в Российской Федерации».

3. Федеральный закон от 04.05.2011 № 99-ФЗ «О лицензировании отдельных видов деятельности».

4. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

5. СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

6. Приказ Минздрава России от 06.12.2021 № 1122н «Об утверждении национального календаря профилактических прививок, календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям и порядка проведения профилактических прививок».

7. Приказ Минздрава России от 28.01.2021 № 29н «Об утверждении порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров работников, предусмотренных частью четвертой статьи 213 трудового кодекса Российской Федерации, перечня медицинских противопоказаний к осуществлению работ с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также работам, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры».

8. Приказ Минтруда России и Минздрава России от 31.12.2020 № 988н/1420н «Об утверждении перечня вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные медицинские осмотры при поступлении на работу и периодические медицинские осмотры».

9. Приказ Минпромторга России от 14.06.2013 № 916 «Об утверждении Правил надлежащей производственной практики».

10. Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях».

11. МУ 1.3.3103-13 «Организация работы лабораторий, использующих методы электронной и атомно-силовой микроскопии при исследовании культур микроорганизмов I — IV групп патогенности».

12. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».

13. ГОСТ 26075 «Животные. Методы лабораторной диагностики бешенства».

14. ГОСТ 33215 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур».

Библиографические ссылки

1. ФС.3.3.1.0038.15 Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4. 2018.

2. ФС.3.3.1.0025.15 Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4. 2018.

3. World Health Organization. Expert Consultation on Rabies. Technical Report Series 1012, Geneva, Switzerland; 2018.

4. Игнатьев Г.М. Молекулярно-генетическое исследование стабильности и подтверждение подлинности штамма Внуково-32, применяемого для производства вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой / Г.М. Игнатьев, А.С. Оксанич, Л.П. Антонова, Т.Г. Самарцева, С.В. Мосолова, К.М. Мефед, Л.В. Гмыль, Н.А. Нетесова // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020. Т. 20. № 2. С. 107 — 115.

5. ОФС 1.7.2.0011.15 Требования к клеточным культурам — субстратам производства биологических лекарственных препаратов. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2. 2018.

6. Методы лабораторных исследований по бешенству. 3-е изд. ВОЗ. Женева, 1975.

7. Laboratory techniques in rabies. 1st Edition. WHO, 1954.

8. Laboratory techniques in rabies. 4th Edition. WHO, 1996.

9. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2022.

10. Laboratory techniques in rabies. 5th Edition. WHO, 2019.