МУ 2.3.2.3687-21. 2.3.2. Гигиена. Гигиена питания. Продовольственное сырье и пищевые продукты. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов животного происхождения, включая рыб и птицу. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 12.02.2021)
Примечание
Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://47.rospotrebnadzor.ru/ по состоянию на 16.04.2021.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 12 февраля 2021 года
2.3.2 ГИГИЕНА. ГИГИЕНА ПИТАНИЯ.
ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ И ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ВКЛЮЧАЯ РЫБ И ПТИЦУ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.3687-21
1. Разработаны ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (В.А. Тутельян, Н.В. Тышко, Э.О. Садыкова, С.И. Шестакова, М.Д. Требух, Н.С. Никитин, Л.В. Кравченко, Л.И. Авреньева, Г.В. Гусева, И.В. Аксенов, И.В. Гмошинский, А.А. Кочеткова, В.А. Саркисян); Российской академией наук (Г.Г. Онищенко); Институтом биоинженерии, ФГУ «ФИЦ Биотехнологии» РАН (М.В. Сухачева, И.В. Яковлева); Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова (М.П. Кирпичников).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой «12» февраля 2021 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУ) устанавливают порядок проведения оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов животного происхождения, включая рыб и птицу (далее — ГМО животного происхождения), предназначенных для производства продовольственного сырья и пищевых продуктов.
1.2. Порядок оценки безопасности, изложенный в настоящих МУ, применяется на этапе государственной регистрации ГМО животного происхождения, впервые поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации.
1.3. МУ разработаны с целью обеспечения единой, научно обоснованной системы оценки безопасности ГМО животного происхождения, и учитывают новые методические подходы, как используемые в Российской Федерации, так и рекомендованные международными организациями.
II. ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМОГО ГМО ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
2.1 Общая характеристика ГМО животного происхождения содержит следующую информацию:
- позволяющую идентифицировать ГМО животного происхождения (вид, порода/линия, трансформационное событие, характеристика отличий от немодифицированного организма);
- об исходном организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения, данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах);
- об организмах — донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, история использования);
- о методах генетической модификации и способах получения ГМО животного происхождения (описание метода модификации, структуры векторов, структуры вставок);
- о ГМО животного происхождения (описание свойств, приобретенных организмами в результате модификаций, описание структур встроенных генетических конструкций и мест их локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза организма, экспрессия в структурных компонентах организма и др.);
- о генетической и фенотипической стабильности, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО животного происхождения.
III. ПРОВЕДЕНИЕ ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ ГМО ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
3.1. Оценка безопасности ГМО животного происхождения проводится в соответствии с пунктами 3.1.1 - 3.1.5 и включает в себя следующие этапы:
- экспертный анализ и оценку данных, представленных заявителем, содержащих результаты ветеринарного освидетельствования ГМО животного происхождения; оценка композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога (содержание нутриентов, витаминов, минеральных веществ в аналогичных органах и тканях); результаты токсикологических, аллергологических и других исследований; результаты пострегистрационного мониторинга в стране-заявителе и других странах;
- экспертную оценку методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО животного происхождения;
- медико-генетическую оценку ГМО животного происхождения;
- оценку функционально-технологических свойств ГМО животного происхождения;
- медико-биологическую оценку безопасности ГМО животного происхождения;
- подтверждение соответствия показателей качества и безопасности ГМО животного происхождения (содержание токсичных элементов, радионуклидов и др.) требованиям технических регламентов Евразийского экономического союза (Таможенного Союза) <1>;
- формирование заключения о результатах оценки безопасности ГМО животного происхождения, оформленное в виде отчета о научно-исследовательской работе.
<1> Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и/или соответствующих технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции.
3.2. Для проведения исследований, предусмотренных разделами 3.1.1 - 3.1.5 настоящих МУ, заявитель представляет образцы ГМО животного происхождения и их традиционных аналогов в количестве, достаточном для выполнения полного объема исследований.
3.1.1 Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих
ГМО животного происхождения
3.1.1.1. Анализ результатов ветеринарного освидетельствования ГМО животного происхождения (выполненного на репрезентативной выборке ГМО обоего пола, содержавшихся в условиях, полностью удовлетворяющих физиологические потребности соответствующего вида организмов, включавшего результаты наблюдения за общим состоянием, поведением, скоростью роста на протяжении всего исследования с периодичностью, используемой в стандартной практике для соответствующего вида организмов, результаты обследований, выполненных в соответствии со стандартной ветеринарной практикой для соответствующего вида организмов — клинические осмотры, лабораторные исследования крови (гематологические и биохимические), мочи, кала, инструментальные исследования (ЭКГ, УЗИ внутренних органов, рентгенография и др.), оценку репродуктивной функции — подтверждение возможности размножения ГМО, и др.).
3.1.1.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании информации о результатах сравнения химического состава ГМО животного происхождения с химическим составом его традиционного аналога, представленной заявителем (содержание белка; аминокислотный состав; содержание жира; жирнокислотный состав; содержание углеводов; макро- и микроэлементов; биологически активных веществ; аллергенов, характерных для исходного вида/породы/линии; содержание антропогенных и природных контаминантов — токсичных элементов, пестицидов, радионуклидов, антибиотиков и др.; содержание антинутриентов и других веществ, характерных для организмов исходного вида/породы/линии).
Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого организма.
Оценка композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для организмов данного вида, и справочных данных о химическом составе исходного вида (породы, линии).
В случае если целью генетической модификации является изменение метаболизма, этот фактор необходимо учитывать при оценке композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога.
3.1.1.3. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- результаты оценки безопасности белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО животного происхождения (молекулярная и биохимическая характеристика белков; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (при использовании международных баз данных, содержащих информацию о белках <2>); изучение стабильности белков при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и pH, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белков к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белков в эксперименте на грызунах и др.);
- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстрорастущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.) в случае, если такие исследования проводились;
- результаты других токсикологических исследований.
<2> Например, Protein Information Resource (PIR), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Universal Protein Resource (SwissProt), International Nucleotide Sequence Database Collaboration (GenBank) и др.
3.1.1.4. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- результаты оценки аллергенных свойств белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО животного происхождения (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белков в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием иммуноглобулинов E, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина и др.); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в том числе in vivo);
- результаты аллергологических исследований нативного продукта (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО животного происхождения с набором аллергенов его традиционного аналога и др.) в случае, если такие исследования проводились;
- результаты других аллергологических исследований.
3.1.1.5. Анализ результатов других исследований, включая результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.
3.1.1.6. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга, осуществляемого в странах, где ГМО животного происхождения был зарегистрирован ранее, проводится в случае, если в процессе мониторинга были получены данные о незаданных эффектах генетической модификации.
3.1.1.7. Анализ научных данных о ГМО животного происхождения, представленных в научной литературе за весь период его использования.
3.1.2 Методы обнаружения, идентификации и количественного
определения ГМО животного происхождения в пищевых продуктах
3.1.2.1. Основным методом, используемым для обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО животного происхождения, является полимеразная цепная реакция (далее — ПЦР) и ее модификации. Также для обнаружения ГМО животного происхождения в пищевых продуктах и продовольственном сырье, не подвергавшихся технологической переработке, могут быть использованы иммунологические методы детекции специфичных для ГМО белков.
3.1.2.2. Экспертная оценка методов идентификации ГМО животного происхождения направлена на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО животного происхождения и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО животного происхождения.
3.1.2.3. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО животного происхождения в пищевых продуктах проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- метод идентификации одного или нескольких трансформационных событий (событие-специфичные тест-системы);
- метод количественного определения одного или нескольких трансформационных событий (событие-специфичные тест-системы);
- протоколы проведения анализов;
- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;
- стандартные образцы состава и свойств.
3.1.3 Медико-генетическая оценка ГМО
животного происхождения
3.1.3.1. Медико-генетическая оценка ГМО животного происхождения включает проверку присутствия всех заявленных генетических конструкций методом ПЦР.
3.1.3.2 Медико-генетические исследования проводятся на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- описание молекулярной структуры всех заявленных генетических конструкций (нуклеотидная последовательность);
- метод идентификации и количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;
- протокол проведения анализа;
- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;
- стандартные образцы состава и свойств.
3.1.3.3. Заключение о результатах медико-генетической оценки ГМО животного происхождения оформляется в виде отчета о научно-исследовательской работе, включающего основные сведения, на основании которых можно судить о присутствии всех заявленных генетических конструкций.
3.1.4 Оценка функционально-технологических
характеристик ГМО животного происхождения
3.1.4.1. Исследования проводятся на основании сравнения функционально-технологических характеристик ГМО животного происхождения и его традиционного аналога.
3.1.4.2. Изучаемые функционально-технологические характеристики (в соответствии со стандартами на конкретный вид исследуемых продуктов):
- сравнительная органолептическая оценка;
- сравнительная оценка структурно-механических характеристик исследуемого продукта и/или его отдельных фракций;
- сравнительная оценка физико-химических характеристик исследуемого продукта и/или его отдельных фракций.
3.1.4.3. Заключение о результатах исследований оформляется в виде отчета о научно-исследовательской работе, включающего основные сведения, на основании которых можно судить о функционально-технологических характеристиках ГМО животного происхождения в сравнении с традиционным аналогом.
3.1.5 Медико-биологическая оценка безопасности ГМО
животного происхождения
3.1.5.1. Исследования проводятся на основании сравнения ГМО животного происхождения с его традиционным аналогом по следующим параметрам: гигиеническая характеристика, токсикологические, генотоксикологические, аллергологические свойства, влияние на репродуктивную функцию и развитие потомства.
Наиболее предпочтительный материал для исследований определяется в зависимости от вида ГМО (животное, птица, рыба) — мясо, молоко, субпродукты, яйца, икра и т.п. При выборе материала следует учитывать, во-первых, соотношение содержания белка, определяющего проявление заданного признака, к общему содержанию белка в материале, во-вторых, предполагаемую частоту использования в рационе человека, в-третьих, степень технологической обработки, традиционно используемой для данного пищевого продукта.
3.1.5.2. Гигиеническая характеристика ГМО животного происхождения включает определение показателей качества и безопасности. Перечень показателей безопасности формируется на основании требований технических регламентов Евразийского экономического союза (Таможенного Союза) <3>.
<3> Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и/или соответствующих технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции.
- содержание токсичных элементов;
- содержание пестицидов;
- содержание диоксинов;
- содержание гистамина;
- содержание нитрозаминов (сумма N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина);
- содержание полихлорированных бифенилов;
- содержание ветеринарных (зоотехнических) препаратов, стимуляторов роста животных (в том числе гормональных препаратов);
- содержание антимикробных средств;
- содержание антипротозойных средств;
- содержание остатков инсектицидов;
- содержание радионуклидов;
- микробиологические показатели;
- другие показатели (в случае необходимости).
3.1.5.3. Перечень показателей качества формируется на основании свойств соответствующего организма, а также анализа представленных заявителем материалов. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной эквивалентности ГМО животного происхождения и его традиционного аналога (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для организмов данного вида), исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов.
3.1.5.4. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО животного происхождения, рекомендуется провести исследования, подтверждающие заявленные изменения.
3.1.5.5. Изучение репродуктивной токсичности и токсичности ГМО животного происхождения проводится в эксперименте на крысах линии Вистар. Токсикологические исследования включают изучение репродуктивной функции крыс поколения F0, пре- и постнатальное развитие потомства поколения F1, а также оценку физиолого-биохимических показателей крыс поколения F0 (на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения). Схема проведения эксперимента представлена в таблице 1.
, 25 
, 50 
На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (далее — ПКР). Исследуемый ГМО животного происхождения и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона проводится с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности.
Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлены в таблицах 2 - 3.
Состав базового полусинтетического казеинового рациона
| Ингредиенты | Кол-во, г | Белок, г | Жиры, г | Углеводы, г | Калорийность | |
| Ккал | % | |||||
| Казеин | 23,949 | 20,21 | 0,36 | - | 84,08 | 23,46 |
| Крахмал маисовый | 59,0 | 0,59 | - | 51,07 | 206,64 | 57,65 |
| Масло подсолнечное нерафинированное | 5,0 | - | 4,99 | - | 44,91 | 12,53 |
| Лярд | 2,0 | - | 1,99 | - | 17,91 | 5,00 |
| Солевая смесь <1> | 3,5 | - | - | - | - | - |
| Смесь в/р витаминов <2> | 1,0 | - | - | 1,0 | 4,00 | 1,11 |
| Смесь ж/р витаминов <3> | 0,1 | - | 0,1 | - | 0,9 | 0,25 |
| L-Цистеин | 0,2 | - | - | - | - | - |
| Холин | 0,25 | - | - | - | - | - |
| Трет-бутилгидрохинон | 0,001 | - | - | - | - | - |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 5,0 | - | - | - | - | - |
| ИТОГО | 100,0 | 20,80 | 7,44 | 52,07 | 358,44 | 100 |
| <1> Состав солевой смеси представлен в таблице 3. <2> 1 г содержит: тиамина (B1) — 0,6 мг, рибофлавина (B2) — 0,6 мг, пиридоксина (B6) — 0,7 мг, никотиновой кислоты — 3,0 мг, пантотената кальция — 1,6 мг, фолиевой кислоты — 0,2 мг, биотина — 0,02 мг, цианокобаламина (B12) — 0,0025 мг, викасола — 0,075 мг, L-метионина — 50 мг, глюкозы — до 1 г. <3> 0,1 мл содержит: ретинола ацетата — 400 МЕ, эргокальциферола — 100 МЕ, \alpha - \text{токоферола} ацетата — 7,5 мг, подсолнечного масла — до 0,1 мл. | ||||||
Физиолого-биохимические показатели состояния здоровья крыс поколения F0 оценивают на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения. Перечень исследуемых показателей и сроки отбора материала для исследований представлены в таблицах 4 - 12.
Общий клинический анализ крови
| Изучаемые показатели [13, 36] | Сроки отбора материала |
|---|---|
| - концентрация гемоглобина; - гематокрит; - общее количество эритроцитов; - средний объем эритроцита; - среднее содержание гемоглобина в эритроците; - средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ); - общее количество тромбоцитов; - тромбокрит; - средний объем тромбоцита; - общее количество лейкоцитов; - дифференцированный подсчет лейкоцитарной формулы (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы) |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
Общий биохимический анализ сыворотки крови
| Изучаемые показатели [13, 36] | Сроки отбора материала |
|---|---|
| - общий белок; - альбумин; - глобулин; - триглицериды; - общий билирубин; - прямой билирубин; - мочевина; - мочевая кислота; - креатинин; - глюкоза; - холестерин; - лактатдегидрогеназа; - альфа-амилаза; - креатинфосфокиназа; - щелочная фосфатаза; - аланинаминотрансфераза; - аспартатаминотрансфераза; - кальций; - магний; - железо; - натрий; - калий; - фосфор; - хлор |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
Общий и биохимический анализ мочи
| Изучаемые показатели [13, 36] | Сроки отбора материала |
|---|---|
| - суточный диурез; - цвет и прозрачность; - относительная плотность; - pH; - белок; - глюкоза; - креатинин; - мочевина; - мочевая кислота; - кальций; - магний; - фосфор |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
Система антиоксидантной защиты
| Изучаемые показатели | Сроки отбора материала |
| Активность ферментов антиоксидантной защиты. Материал для исследований: эритроциты [11, 12, 28, 29, 31, 33] - глутатионредуктаза; - глутатионпероксидаза; - супероксиддисмутаза; - каталаза | У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
| Содержание продуктов перекисного окисления липидов. Материал для исследований: кровь, печень [7, 24, 27] - малоновый диальдегид |
| Изучаемые показатели | Сроки отбора материала |
|---|---|
| Общая и неседиментируемая активность ферментов лизосом [4] Материал для исследований: печень - \beta - \text{Галактозидаза} ; - \beta - \text{Глюкуронидаза} ; - арилсульфатазы A и B |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 10 на группу |
Система ферментов метаболизма ксенобиотиков
| Изучаемые показатели | Сроки отбора материала |
|---|---|
| Активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков [22, 23, 26, 30, 34] Материал для исследований: печень - общее содержание цитохрома р-450; - этоксирезоруфиндеалкилаза; - пентоксирезоруфиндеалкилаза; - УДФ-глюкуронозилтрансфераза; - ХДНБ-глутатионтрансфераза |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 10 на группу |
Интенсивность процессов апоптоза
| Изучаемые показатели | Сроки отбора материала |
|---|---|
| Щелочной гель-электрофорез изолированных клеток (метод «ДНК-комет») [18] Материал для исследований: печень, тимус, почки - Индекс апоптоза; - Степень фрагментации ДНК |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
| Исследуемые органы | Методы исследований [1, 6, 8 - 10, 14 - 17, 21] |
| - головной мозг; - гипофиз; - сердце; - тимус; - легкие; - печень; - селезенка; - почки; - надпочечники; - жкт: желудок, тонкая и толстая кишки; - яичники; - семенники; - простата | Отбор материала у самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу. 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования: - обзорные гистологические исследования 3. Морфометрический анализ |
| Вскрытие погибших в течение эксперимента животных (внеплановый отбор) 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования (перечень исследуемых органов может быть сокращен до минимально необходимого для установления причины смерти): - обзорные гистологические исследования | |
| Дополнительные исследования 1. Микроскопические исследования: - гистохимические исследования; - иммуногистохимические исследования клеточных популяций и их производных 2. Электронно-микроскопические исследования |
Репродуктивную функцию оценивают по генеративной и эндокринной функции гонад родительских животных поколения F0, пренатальному и постнатальному развитию потомства поколения F1. Перечень исследуемых показателей и сроки отбора материала для исследований представлены в таблицах 13 - 15.
Показатели, характеризующие генеративную функцию
| Изучаемые показатели [19, 20] | Сроки сбора данных |
| Эффективность спаривания самцов и самок. Оценивают по способности к оплодотворению самок и самцов, выраженную в процентном соотношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов. Для получения потомства F1 самок F0 ссаживают с самцами F0 в соотношении 2:1 не менее чем на 7 дней | В период ссаживания половозрелых крыс поколения F0 (возраст не менее 100 дней) с целью получения потомства F1 для оценки постнатального развития. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 30 на группу |
| Эндокринная функция яичников и семенников. Оценивают по содержанию эстрадиола, прогестерона и тестостерона в сыворотке крови | У беременных самок поколения F0 — на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу. У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу |
| Дополнительные исследования | |
| Спермограмма. Оценивают макроскопические параметры эякулята — pH, объем спермы, цвет, время разжижения и вязкость эякулята, а также характеристики клеточных элементов спермы — количество, подвижность, жизнеспособность, морфологию сперматозоидов, количество и типы лейкоцитов, количество и типы незрелых клеток сперматогенеза и пр. | У половозрелых самцов поколения F0 или F1 (возраст не менее 100 дней). Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу |
| Морфологические исследования семенников (определяют индекс сперматогенеза, среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза) | У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
| Морфологические исследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и более слоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее количество генеративных форм) | У беременных самок поколения F0 — на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу |
Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства
| Изучаемые показатели [19, 20] | Сроки сбора данных |
| Эвтаназия и вскрытие не менее 15 беременных самок на группу | 20-й день беременности |
| Визуальное исследование матки, плаценты, плодов: выявление живых и мертвых плодов, подсчет количества желтых тел, мест имплантации, количество резорбций по правому и левому рогу матки (с последующим вычислением пред- и постимплантационной гибели) | |
| Оценка развития плодов: макроскопический осмотр, определение массы и краниокаудального размера плодов. После осмотра, измерения и взвешивания плоды каждого помета необходимо разделить на три равные группы: одна группа предназначена для вскрытия, выделения и взвешивания внутренних органов (печени, почек, сердца, легких); плоды второй группы фиксируют в жидкости Буэна и используют для изучения внутренних органов по методу Вильсона; плоды третьей группы фиксируют в 96° этаноле и используют для изучения состояния скелета по методу Доусона |
Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства
| Изучаемые показатели [5, 19, 20] | Сроки сбора данных |
|---|---|
| Контроль рождения потомства | самки поколения F0, 22 — 25-й дни беременности |
| Определение средней величины помета, подсчет количества живых и мертвых крысят, подсчет особей разного пола, выявление внешних уродств | 1-й день жизни крысят поколения F1 |
| Измерение массы тела и роста (краниокаудального размера) крысят поколения F1 | 2, 5, 10, 15, 20 и 25 дни жизни крысят поколения F1 |
| Учет показателей физиологического развития крысят: срок отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускание семенников, открытие влагалища | 1 — 35 дни жизни крысят поколения F1 |
| Вычисление выживаемости потомства с 1-го по 5-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 5-го дня, к числу родившихся живыми) и с 6-го по 25-й день жизни (отношение числа крысят, доживших до 25-го дня, к числу доживших до 6-го дня), выраженное в процентах | 1 — 25 дни жизни крысят поколения F1 |
| Определение соотношения самцов и самок в пометах | 1 — 10 дни жизни крысят поколения F1 |
В раздел отчета по результатам изучения репродуктивной токсичности и токсичности ГМО животного происхождения рекомендуется включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на интегральные, физиолого-биохимические показатели состояния здоровья, репродуктивную функцию и развитие потомства подопытных животных.
3.1.5.6. Иммунологические исследования ГМО животного происхождения проводятся в эксперименте на мышах линий CBA и C57Bl/6 и включают изучение его иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:
- действие на гуморальное звено иммунитета — в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;
- действие на клеточное звено иммунитета — в реакции гиперчувствительности замедленного типа (далее — ГЗТ) к эритроцитам барана;
- действие как сенсибилизирующего агента — в тесте чувствительности к гистамину;
- действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).
В таблице 16 представлены сравнительные характеристики мышей линий CBA и C57Bl/6. Схема проведения эксперимента представлена в таблице 17.
Характеристики мышей линий CBA и C57Bl/6
| Действующий фактор | Линия мышей | |
| CBA | C57Bl/6 | |
| Эритроциты барана | высокочувствительны | низкочувствительны |
| Гистамин | не чувствительны | чувствительны |
| Salmonella typhimurium | не чувствительны | чувствительны |
| Ключевые элементы системы планирования эксперимента | Рекомендуемые условия |
| Вид животных | Мыши линий CBA и C57Bl/6 |
| Пол | Самцы |
| Возраст | Половозрелые |
| Исходная масса тела | 18 — 20 г |
| Количество животных в группе в начале эксперимента | Не менее 120 мышей линий CBA в каждой группе Не менее 120 мышей линий C57Bl/6 в каждой группе |
| Распределение по группам | Животных каждой линии делят на 2 группы: Группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; Группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО |
| Рацион <*> | Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных |
| Карантин | Не менее 7 дней |
| Условия содержания | Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении |
| <*> Состав базового рациона приведен в таблице 2. | |
Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на экспериментальные рационы. В течение эксперимента проводят наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных.
3.1.5.6.1. Влияние ГМО животного происхождения на гуморальный иммунный ответ оценивают на основании титров антител после иммунизации эритроцитами барана мышей высокоотвечающей (CBA) и низкоотвечающей (C57BL/6) линий. Для иммунизации животных следует использовать минимальные дозы (5 x 106) антигена.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (10 млн клеток/мл). Отбор крови для исследований проводят на 7-й, 10-й и 14-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют общепринятым методом в реакции гемагглютинации [19]. Реакция основана на способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, склеивать (агглютинировать) эритроциты барана. В 96-луночных плоскодонных планшетах готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10. В контрольную лунку вносят 0,5 мл физиологического раствора. Ко всем лункам добавляют 0,5 мл 1% эритроцитов барана. Учет реакции ведется после инкубации планшетов в термостате в течение 2 ч при 37 °C. При положительном результате эритроциты оседают на дне лунки планшета в виде зонтика, при отрицательном — в виде пуговки. За титр принимают то последнее разведение исследуемой сыворотки, при которой еще наблюдается положительный результат. Контрольная лунка должна быть отрицательной. Полученные данные обрабатывают методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты приводятся в виде M +/- m, где M — выборочное среднее измеряемых величин, m — стандартная ошибка.
3.1.5.6.2. Влияние ГМО животного происхождения на клеточный иммунный ответ оценивают на основании реакции гиперчувствительности замедленного типа. При выполнении теста антиген вводят двукратно: для сенсибилизации и для разрешения.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозу эритроцитов барана — 0,02 мл (100 млн клеток/мышь); в контрлатеральную лапу — 0,02 мл 0,95%-го раствора хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 — 20 часов путем определения массы опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции [19].
3.1.5.6.3. Действие ГМО животного происхождения как сенсибилизирующего агента оценивают в тесте чувствительности к гистамину.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по проценту гибели мышей [25].
3.1.5.6.4. Влияние ГМО животного происхождения на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium оценивают на модели внутрибрюшинного заражения мышей десятикратно отличающимися дозами Salmonella typhimurium штамм 415. Через 21 день эксперимента мышей контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами культуры: 1 000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют ЛД50, а также процент гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ результатов [2].
3.1.5.7. Аллергологические исследования ГМО животного происхождения проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровень циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа «опыт») и его традиционный аналог (группа «контроль»). Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (далее — в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном — овальбумином куриного яйца (далее — ОВА) с последующим введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка [32]. Схема проведения эксперимента представлена в таблице 18.
| Ключевые элементы системы планирования эксперимента | Рекомендуемые условия |
|---|---|
| Вид животных | Крысы линии Вистар |
| Пол | Самцы |
| Возраст | Половозрелые |
| Исходная масса тела | 150 — 180 г |
| Количество животных в группе в начале эксперимента | Не менее 25 особей в каждой группе |
| Распределение по группам | Животных делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО |
| Рацион (состав базового рациона представлен в табл. 19) | Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных. Рацион не содержит яичного белка |
| Карантин | Не менее 7-ми дней |
| Условия содержания | Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении |
| Продолжительность эксперимента | 29 дней |
| Отбор материала для исследований | На 29-й день эксперимента |
На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную («бустерную») дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор ОВА, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса [35]. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1 — 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.
Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА проводят согласно проводят по протоколу, описанному в статье Гмошинского И.В. и др., 1994 [3]. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Манна-Уитни.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.
2. Ведомости фармакологического комитета. 1999. № 1. С. 31 — 36.
3. Гмошинский И.В., Кржечковская В.В., Пятницкий Н.Н.//Вопросы питания. 1994. № 1, 2. С. 30 — 33.
4. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир, 1980. 344 с.
5. Западнюк И.П. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. 3-е изд. Киев: Вища школа, 1983. 383 с.
6. Киселева А.Ф. и др. Морфофункциональные методы исследования в норме и при патологии. К.: Здоров'я, 1983. 163 с.
7. Костюк В.А., Потапович А.И.//Вопр. мед. химии. 1987. № 3. С. 115 — 118.
8. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.
9. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир, 1982. 272 с.
10. Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980. 343 с.
11. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В.//Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 56 — 58.
12. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А.//Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 59 — 61.
13. Меньшиков В.В. (Ред.) Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.
14. Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. М.: Медицина, 1996. 544 с.
15. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. С.-Пб.: Лань, 2001. 464 с.
16. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. В 2-х т. М.: Медицина, 2000. 1944 с.
17. Полак Д., Норден С.В. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. 74 с.
18. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. М., 2006. 27 с.
19. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств/Под ред. Миронова А.Н. Ч. 1. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
20. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Под ред. Хабриева Р.У. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ОАО «Издательство „Медицина“, 2005. 832 с.»
21. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина, 1993. 688 с.
22. Burchell B., Weatherill P.//Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 169 — 176.
23. Burke M.D., Mayer R.T.//Chem.-Biol. Interact. 1983. Vol. 45. P. 243 — 258.
24. Ernster L., Nordenbrandt K.//In Methods in Enzymology. Oxidation and phosphorilation. Estabrook R.W., Pullman M.E., eds., Ac. Press N.Y. 1967. Vol. 10. P. 574 — 580.
25. FAO/WHO Protein quality evaluation. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation Held in Bethesda, Md, USA, 4 — 8 December, 1989, FAO Rome. 2 p.
26. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B.//J. Biol. Chem. 1974. Vol. 294. P. 7130 — 7139.
27. Michara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. 1980.//Biochem. Med. Vol. 23, Issue 3. P. 302 — 311.
28. Mills G.C.//J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. № 3. P. 502 — 506.
29. Niashikimi M., Rao N., Jagi K.//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46. P. 849 — 854.
30. Omura T., Sato R.//Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 2370 — 2378.
31. Oshino N., Chance B.//Arch. Biochem. Biophys. 1973. Vol. 154. № 1. P. 117 — 131.
32. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity. Food allergy and intolerance. London. 1987. P. 286 — 300.
33. Tillotson J.A., Sauberlich H.E.//J. Nutrition. 1971. Vol. 101. P. 1459 — 1466.
34. Umegaki K., Saito K., Kubota Y. et al.//Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90. P. 345 — 351.
35. Weigle W., Cochrane C., Dixon F.//J. Immunology. 1960. Vol. 85. P. 469 — 477.
36. Weingard K., Brown G., Hall R. et al.//Fundamental and applied toxicology. 1996. Vol. 29. P. 198 — 201.