МР № 02.012-06. Определение бактерий рода Listeria методом твердофазного иммуноферментного анализа. Методические рекомендации

(утв. Роспотребнадзором 08.12.2006)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА LISTERIA МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ № 02.012-06

1. Разработаны: ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, при участии ООО «Стай-лаб».

2. Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (от 29 сентября 2006 г.).

3. Утверждены и введены в действие Председателем Лабораторного совета, Главным врачом ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора Верещагиным А.И. 08.12.2006.

4. Введены впервые.

1. Область применения

Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль, а также в лабораториях иных организаций, аккредитованных на право проведения испытаний, исследований.

Методические рекомендации могут быть использованы для целей определения бактерий рода Listeria при скрининговых исследованиях пищевых продуктов и смывов.

2. Общие положения

Бактерии рода Listeria относятся к группе грамположительных подвижных бактерий, широко распространенных в окружающей среде и размножающихся в почве, воде, на растениях, в пищевых продуктах.

Известны семь видов листерий: Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria grayi, Listeria murrayi, Listeria seeligeri и Listeria welshimeri. Эпидемиологическое значение имеют Listeria monocytogenes, Listeria innocua и Listeria ivanovii в связи с наиболее частой контаминацией этими представителями рода Listeria пищевых продуктов.

Поэтому чрезвычайно важна организация скрининга с использованием высокоспецифичных и простых методов определения бактерий рода Listeria. Хотя патогенной для человека является только Listeria monocytogenes, присутствие в пробах любых других листерий может свидетельствовать о контаминации патогенными бактериями.

3. Принцип метода твердофазного варианта ИФА

К иммунохимическому определению бактерий рода Listeria в пищевых продуктах, смывах относится твердофазный иммуноферментный анализ на полистироловых планшетах, покрытых моноклональными антителами к антигену бактерий рода Listeria. Результатом проведения ИФА служит образование комплекса антиген-антитело при исследовании тестируемых образцов в сравнении с негативными и позитивными контролями. Использование твердой фазы позволяет надежно разделять компоненты реакции за счет иммобилизации одного из компонентов, не участвующих в реакции.

Для осуществления реакции данного типа используется тест-система LOCATE(R) Listeria с высокоспецифичными моноклональными антителами к антигенам бактерий рода Listeria. Тест-система LOCATE(R) Listeria спроектирована в формате стрипованного 96-луночного ИФА-планшета, что позволяет выполнять исследования от 1 до 94 образцов одновременно как с визуальной, так и с автоматической оценкой результата (с помощью ридера).

4. Аппаратура, материалы, питательные среды и тест-системы

Термостат электрический с диапазоном измерения от 15 до 65 °С с допустимой погрешностью регулирования температуры +/- 1 °С	ТУ 64-1-1382-83
Стерилизатор паровой медицинский	ГОСТ 19569
Шкаф сушильно-стерилизационный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима в диапазоне от 50 до 200 °С с погрешностью +/- 2 °С
Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа Masticator (или Stomacher) со стерильными полиэтиленовыми пакетами
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150	ТУ 16-535-84
Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допустимой погрешностью +/- 2 мг	ГОСТ 24104
Холодильник бытовой электрический	ГОСТ 16317
Пипетки градуированные исполнения 1, 2 классов точности вместимостью 1 куб. см, 10 куб. см	ГОСТ 29227
Пробирки бактериологические вместимостью не менее 10 куб. см	ГОСТ 25336
Посуда широкогорлая	ГОСТ 25336
Питательные среды: Половинный бульон Фразера для обогащения листерий Бульон Фразера Оксфорд-агар PALCAM-агар
Компоненты набора тест-системы LOCATE(R) Listeria:
Микротитровальный стрипованный планшет на 96 лунок, покрытых моноклональными антителами на листерии	1 шт.
Конъюгат, в рабочем разведении	1 шт.
Положительный контроль (термически дезактивированные бактерии рода Listeria), 2 мл	1 шт.
Отрицательный контроль (термически дезактивированные бактерии), 2 мл	1 шт.
Концентрирующий моющий буфер, 25-кратный, 20 мл	2 шт.
Субстрат, ТМБ, 15 мл	1 шт.
Стоп-реагент, содержит 2% раствор серной кислоты, 15 мл	1 шт.
Схема планировки планшета	1 шт.

5. Отбор и подготовка проб к анализу

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96), ГОСТ Р 51921-02 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes», МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах», а также в соответствии с действующими ГОСТ и НД на конкретные виды продуктов.

5.2. Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования и превышать аналитический образец не менее чем в два раза.

5.3. От продукции в мелкой фасовке пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары так, чтобы количество было достаточным для проведения анализа.

5.4. От продукции в транспортной и потребительской таре больших размеров или без упаковки пробы отбирают из разных точек: с поверхности и с различной глубины.

5.5. Пробы для микробиологических анализов отбирают стерильным инструментом в стерильную посуду до взятия проб на физико-химические и органолептические исследования.

5.6. Замороженные продукты предварительно размораживают до температуры внутри продукта 0 — (-1) °С (не менее 1 ч в термостате при температуре 37 °С); продукты, содержащие жиры (сливочное масло, мороженое), нагревают до температуры 40 — 45 °С и перемешивают.

5.7. Отобранные образцы перемешивают и измельчают или доводят до однородной консистенции по ГОСТ 26669-85, из измельченной суспензии составляют навеску массой 25 +/- 0,1 г (50 — 100 г или 50 — 100 куб. см — для продуктов детского, лечебного и специализированного питания).

5.8. Смывы отбирают с помощью стерильных увлажненных тампонов, сделанных из марли или ваты, с поверхности оборудования и инвентаря площадью 100 кв. см, используя трафарет. Трафарет фламбируют перед каждым употреблением.

6. Определение бактерий рода Listeria в пищевых продуктах методом твердофазного иммуноферментного анализа

6.1. Предобогащение: внести 25 г подготовленной пробы в 225 мл бульона предобогащения. Перемешать образец в стомахере, блендере или с помощью другой техники, обеспечивающей достаточно хорошее перемешивание. Инкубировать в течение 24 ч при 30 °С.

6.2. После инкубации перенести по 0,1 мл предобогащенной пробы в 10 мл бульона Фразера. Инкубировать бульоны в течение 24 ч при 30 °С.

6.3. После инкубации перенести по 1 мл в две стеклянные пробирки, одну пробирку проавтоклавировать при 100 °С (допускается использовать водяную баню 80 °С в течение 20 мин. для инактивации живых бактерий). Другую пробирку с бульоном (не термообработанную) поместить в холодильник до конца исследования.

6.4. Охладить пробу до комнатной температуры. Тщательно перемешать бульон после охлаждения и использовать для ИФА.

7. Подготовка реагентов для ИФА

7.1. Для анализа используется тест-система иммуноферментная LOCATE(R) Listeria производства R-Biopharm Rhone Ltd.

7.2 Приготовление рабочих разведений растворов, входящих в комплект тест-системы:

7.2.1. Подготовить моющий буфер в рабочем разведении: разбавить концентрат моющего буфера в 25 раз дистиллированной водой (смешать 40 мл буфера и 960 мл дистиллированной воды). Отметить дату приготовления на флаконе с буфером. Хранить буфер в холодильнике.

7.2.2. Рабочий раствор конъюгата: конъюгат поставляется в рабочем разведении.

7.2.3 Субстрат (ТМБ) поставляется в рабочем разведении.

7.2.4 Стоп-реагент поставляется в рабочем разведении.

7.2.5. Положительные и отрицательные контроли поставляются в рабочем разведении.

8. Проведение иммуноферментного анализа

8.1. Извлечь из пакета необходимое количество стрипов, разделить на необходимое количество лунок (по одной лунке на каждую пробу) и 2 лунки для контрольных растворов. Поместить лунки в планшетную рамку и зафиксировать. Немедленно упаковать оставшиеся лунки в пакет вместе с силикагелем.

8.2. Внести по 100 мкл растворов положительного и отрицательного контроля в соответствующие лунки. Внести по 100 мкл исследуемых термообработанных бульонов в соответствующие лунки. Обозначить положение каждой лунки на прилагаемой диаграмме. Инкубировать планшет в темноте при температуре 37 °С 30 мин.

8.3. После инкубации с помощью автоматического вошера или многоканальной автоматической пипетки с переменным объемом внести в каждую лунку по 250 мкл моющего буфера. Повторить процедуру промывания еще 3 раза, после чего промыть лунки 1 раз дистиллированной водой. Перевернуть рамку и тщательно выбить капли дистиллированной воды путем постукивания рамки по столу, накрытой фильтровальной бумагой.

8.4. Внести по 100 мкл конъюгата в каждую лунку (при необходимости использования большого количества лунок использовать 8-канальную автоматическую пипетку). Инкубировать планшет при температуре 37 °С 30 мин.

8.5. По окончании инкубации промыть лунки планшета, как описано в п. 8.3.

8.6. Внести по 100 мкл субстрата в каждую лунку (при необходимости исследования большого количества образцов использовать ванночку для реагентов и 8-канальную пипетку). Чтобы снять излишки субстрата с верхнего края лунок, необходимо промокнуть лунки фильтровальной бумагой. Немедленно поставить планшет в темноту, инкубировать его при комнатной температуре 30 мин.

8.7 Учет результатов:

• При визуальной интерпретации результатов: считывание результатов проводится сразу после инкубации. Стоп-реагент не добавляется.
• При автоматизированном учете результатов: по окончании инкубации добавить в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента. В течение 5-ти минут (не более) после добавления стоп-реагента измерить оптическую плотность в каждой лунке, используя фотометр планшетный (ридер) с длиной волны 450 им.

9. Интерпретация результатов

9.1 Интерпретации результатов, полученных с помощью ридера:

9.1.1. При значении оптической плотности 0,3 и менее результат расценивается как отрицательный — в исследуемой пробе пищевого продукта бактерии рода Listeria не обнаружены.

9.1.2. При значении оптической плотности более 0,3 проба пищевого продукта расценивается как положительная, и требуется подтверждение наличия в пробе жизнеспособных бактерий рода Listeria.

9.2 Интерпретация результатов при визуальном учете:

9.2.1. При окраске содержимого лунки в синий цвет результат расценивается как положительный, и требуется подтверждение наличия в пробе жизнеспособных бактерий рода Listeria.

9.2.2. При окраске содержимого лунки в прозрачный или бледно-голубой цвет результат расценивается как отрицательный, то есть проба пищевого продукта не содержит бактерий рода Listeria.

10. Подтверждение положительных результатов

10.1. Из бульона Фразера, не подвергавшегося термообработке, провести высев на плотные питательные среды (не менее 2). Инкубировать при температуре 30 °С в течение 24 — 48 часов. При наличии подозрительных колоний провести биохимическое и серологическое типирование.

10.2. При положительном результате биохимического и серологического типирования проба пищевого продукта считается положительной и расценивается как содержащая жизнеспособные бактерии рода Listeria.

11. Способы отбора смывов

11.1. В ходе производственного контроля пищевых предприятий, вырабатывающих и реализующих пищевые продукты, широко используется метод смывов с целью контроля эффективности санитарной обработки инвентаря, оборудования, посуды, санитарной одежды и рук персонала. Метод смывов дает возможность оценить санитарно-эпидемиологическое состояние обследуемых объектов.

11.2. Отбор смывов производится с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробки для пробирок, заготавливают заранее в лаборатории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливается (в асептических условиях) по 5 мл бульона предобогащения (половинный бульон Фразера) таким образом, чтобы тампон не касался жидкости.

11.3. Непосредственно перед отбором смыва с поверхности тампон опускают в жидкость.

11.4. При проведении отбора смывов необходимо использовать трафарет в соответствии с установленным порядком контроля объектов. После отбора смывов пробирки со средой обогащения вместе с тампоном необходимо поместить в термостат на 24 ч, инкубировать при 30 °С.

11.5. Далее исследование проводится в соответствии с п. п. 6.2 - 6.4.

12. Требования к помещениям и технике безопасности

Работа по определению бактерий рода Listeria методом твердофазного иммуноферментного анализа должна осуществляться в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами», ГОСТ Р 51446 «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

13. Чувствительность метода

13.1. Чувствительность метода составляет: 1 КОЕ бактерий рода Listeria на 25 г пробы пищевого продукта до этапа предобогащения (по данным инструкции производителя тест-системы). 5

13.2. Чувствительность метода перед детекцией в ИФА — от 100 до 10 — 6 10 жизнеспособных бактерий рода Listeria в 1 мл культуральной жидкости.

---